14 第14章 植物基因工程与作物育种.pptx

第1页：转基因技术与作物改良目录

• 转基因技术与作物改良
• 转基因技术的概括
• 转基因育种的关键技术
• 转基因作物的遗传特点
• 转基因作物的选育

第2页：转基因的概念

• 1节转基因技术的概括
• 1、转基因的概念
• 2、转基因的基本流程
• 3、转基因的作用
• 4、转基因的发展趋势

第3页：转基因的概念利用分子生物学技术

• 1.转基因的概念利用分子生物学技术，把从其它生物体分离的基因或人工构建的基因，通过适当的基因转化方法插入到植物基因组中，得到基因表达产物，并能遗传至后代
• 通过遗传转化不但可以进行种间、属间、科间遗传物质交流，还可以进行高等与低等植物，甚至动物与植物间遗传物质交流
• 同时可以定向而不改变原来的优良性状

第4页：传统育种法:转基因途径:相关的品种亚种种

传统育种法:转基因途径:相关的品种亚种种基因转移相关的品种亚种种动物植物噬菌体真菌细菌病毒

第5页：转基因的基本流程

2转基因的基本流程

第6页：转基因的基本流程

• 转基因的基本流程
• 1.目的基因的获得
• 2.目的基因重组质粒的构建
• 3.受体材料的选择
• 4.外源基因的转化
• 5.转化体的筛选和鉴定
• 6.转化体的安全性评价和育种利用

第7页：人口增长与粮食安全、环境与污染

• 3.转基因的作用
• Population and food security problem
• Agricultural sustainability problem
• Environmental problem
• Specific needs for human life

第8页：人口增长与粮食安全（转基因技术与作物）

Population and food security problem

第9页：作物产量（转基因技术与作物）

Average annual increase in yields of rice, wheat and maize indeveloping countries by periods. (Conway andToenniessen, 1999, Nature) Agricultural sustainability problem

第10页：作物产量、分子遗传

Vega-Sa´nchez et al.,Genetic and biotechnological approaches for biofuel cropimprovement. Current Opinion in Biotechnology 2010, 21:218–224Biofuel

第11页：肥料与养分利用、环境与污染

Fertilized to death,Nosengo, 2003, Nature Environmental problem

第12页：Reduce

Reduce the cost■Specific needs for developing countries

第13页：品质性状（转基因技术与作物）

Better nutritionfood allergy

第14页：

第15页：品质性状（转基因技术与作物）

Phamaceutical protein and vaccine

第16页：

第17页：

第18页：分子遗传（转基因技术与作物）

4. Trades of plant genetic engineering◆rapid increasing areas

第19页：转基因育种、作物产量

Time scale of genetically modified characters in crop plants◆Diverse transgenic types

第20页：转基因育种、组织培养与花药培养

• Particle bombardment
• Ovary-drip transformation
• vacuum infiltration of the matureembryo◆Simple, high-efficient plant transformation methods

第21页：植物遗传转化的受体系统

• 2节转基因育种的关键技术
• 1植物遗传转化的受体系统
• 2植物遗传转化的载体系统
• 3植物遗传转化主要方法
• 4转基因植株检测的主要方法

第22页：植物遗传转化的受体系统植物转化的目的

• 1植物遗传转化的受体系统植物转化的目的：让外源基因稳定地插入植物染色体组中，并再生出完整植株。作为转化受体应符合两个条件
• 能够接收外源DNA
• 必须具有脱分化和再生能力

第23页：转化方法细胞或组织类型农杆菌介导

转化方法细胞或组织类型农杆菌介导，基因枪等直接分化系统(子叶和胚轴等)电击法,PEG,脂质体,微注射等原生质体系统基因枪，超声波等愈伤组织系统农杆菌介导,基因枪,超声波等胚状体系统花粉管通道，子房注射等种质系统（花粉、卵细胞）不同的受体系统及其转化方法

第24页：直接分化系统特点外植体细胞可越过脱分化产

• 1.1直接分化系统特点外植体细胞可越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株:1)省略了愈伤组织诱导过程，获得再生植株的周期短，操作简便
• 2)由于直接分化，因此体细胞无性系变异小，外源基因能稳定遗传
• 3 )由于直接分化困难，转化频率较低
• 4 )不定芽的再生常起源于多细胞，易出现嵌合体

第25页：原生质体系统特点原生质体

• 1.2原生质体系统特点原生质体：去璧后的“裸露”细胞
• 1）无细胞璧，通透性好，外源DNA易于导入
• 2）可适用的转化方法多
• 3）培养形成的细胞无性系变异强烈，稳定性差
• 4）培养技术难度大，应用有局限

第26页：转基因育种、分子遗传

General scheme forAgrobacterium-mediated transformation of cerealplants

第27页：愈伤组织系统特点愈伤组织

• 1.3愈伤组织系统特点愈伤组织：外植体经组织培养产生的脱分化细胞团.1）由脱分化的分生细胞组成，外源DNA易于导入，转化率高
• 2）培养技术难度小，可应用于多种植物
• 3）可继代扩增，获得大量转化植株
• 4）培养形成的再生植株无性系变异大，转化的目的基因遗传稳定性差

第28页：种质系统特点种质系统

• 1.4种质系统特点种质系统：以生殖细胞为受体进行基因转化的系统
• 1）接受外源DNA能力强，转化率高
• 2）受体为单倍体，外源基因表达充分，易选择，加倍后可简化和缩短育种纯化过程
• 3）遗传操作只能在短暂的开花期进行

第29页：胚状体系统特点胚状体

• 1.5胚状体系统特点胚状体：经体细胞胚发生而形成的形态结构和功能上类似于有性胚的结构，较为理想的系统
• 1）接受外源DNA能力强，转化率高
• 2）胚状体多为单细胞发生，遗传背景一致，无性系变异小，转化率高
• 3）可以制成人工种子，利于转基因植株的推广

第30页：用于植物遗传转化的载体系统载体

• 2用于植物遗传转化的载体系统载体：携带外源基因进入受体细胞的运载工具
• DNA片段+适合的载体DNA →重组DNA →在载体DNA的运载下，高效率地进入受体细胞，并在其中进行复制

第31页：载体的基本条件

• 2.1载体的基本条件
• 1)能独立的自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制
• 2）具有多克隆位点，即具有多个限制酶切点
• 3）至少有一个遗传标记基因
• 4）易于宿主细胞收回

第32页：植物转化载体的基本结构

• 1.2植物转化载体的基本结构
• 1）具有细菌的复制起始点
• 2）原核生物中表达的选择标记基因
• 3）多克隆位点
• 4）能在植物中表达的标记基因:标记基因和报告基因

第33页：农杆菌转化载体系统

1.3农杆菌转化载体系统

第34页：

第35页：以Ti质粒为基础构建的载体系统目的基因克

以Ti质粒为基础构建的载体系

以Ti质粒为基础构建的载体系统目的基因克隆载体:保存和克隆目的基因，通常是多拷贝的大肠杆菌质粒

中间载体

中间克隆载体，大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构成

中间表达载体

中间表达载体，含植物特异启动子的中间载体，作为构建转化载体的质粒

卸甲载体

解除武装（切除致瘤基因）的Ti或Ri质粒，是构建转化载体的受体质粒

植物基因转化载体

最后用于目的基因导入植物细胞的载体，由中间表达载体和卸甲载体构建而成

分一元载体系统和二元载体系统

分一元载体系统和二元载体系统

第36页：转基因技术与作物改良要点

大肠杆菌质粒（克隆载体）＋T-DNA片段＋目的基因＋标记基因中间克隆载体中间表达载体植物基因转化载体（一元载体和二元载体）卸甲载体+＋植物特异启动子Ti或Ri质粒

第37页：元载体(共整合载体

一元载体(共整合载体，intergratedvectors)这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因（中间表达载体），另一个是具有Vir区的卸甲载体，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合成一个载体

第38页：转基因育种（转基因技术与作物）

A, Co-integration/exchangesystemsB,T-DNA binary vector systems

第39页：双元载体：辅助质粒

• 双元载体(binary vectors)：同一个农杆菌细胞中含有两个彼此相容的Ti质粒
• ①辅助质粒（helper plasmid）：缺失T-DNA序列的Ti质粒，但有毒性功能的Vir区
• ②克隆质粒（穿梭质粒）：含有T-DNA序列的寄主广泛的DNA转移载体质粒
• 既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制
• 按照标准的DNA操作方法可将任何目的基因插入T-DNA区，构成克隆载体
• 含有双元载体的根癌农杆菌细胞侵染植物时，就可将含有外源目的基因的T-DNA整合进入植物染色体中

第40页：

第41页：植物病毒衍生的载体系统

1.4植物病毒衍生的载体系统

第42页：植物遗传转化方法

• 3植物遗传转化方法
• 3.1农杆菌介导的基因转移
• 3.2基因枪转化系统
• 3.3其他基因转化方法

第43页：转基因育种、原生质体融合

Agrobacteriumremainedthe favoured DNAdelivery method for thetransformation of plantsby 57% , followed byparticle bombardment(25%) and direct transferof DNA into protoplasts(14%).

第44页：农杆菌转化的方法

• 3.1、农杆菌转化的方法1）实现农杆菌转化的条件
• 植物外植体能够产生乙酰丁香酮等可诱导Vir基因的活性物质
• 农杆菌能够接近具有再生能力的感受态植物细胞

第45页：Tzvi Tzfira

Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky, 2002, Trends in Cell Biol. 12(3), 121-129Cellular process ofAgrobacterium–host interaction

第46页：

第47页：

第48页：

第49页：

第50页：农杆菌介导的主要步骤

• 2）农杆菌介导的主要步骤
• 目的（或外源）基因克隆到Ti质粒载体上,构成重组质粒
• 重组质粒转化土壤农杆菌
• 土壤农杆菌菌株与植物组织或者是细胞共培养、除菌
• 转化细胞的培养和再生
• 再生植株的鉴定和检测

第51页：分子标记与基因位点、转基因育种

Production of transgenic plantsIsolate and clone gene of interestAdd DNA segments to initiate orenhance gene expressio Add selectable markersIntroduce gene construct into plantcells (transformation)Select transformed cells or tissuesRegenerate whole plants

第52页：常用的转化方法△叶圆片法

• 3）常用的转化方法△叶圆片法（Horsch，1985）
• 用打空器取叶圆片
• 浸泡在农杆菌溶液中过夜
• 在培养基上培养2～3天
• 在选择性培养基上，使转化细胞直接再生

第53页：共培养法步骤

• △共培养法步骤
• 将外植体与农杆菌共培养24～48h
• 洗去农杆菌，在含有抑菌剂的培养基上培养
• 选择转化体

第54页：转基因育种（转基因技术与作物）

Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary node system.

第55页：直接接种法步骤

• △直接接种法步骤
• 用农杆菌接种离体培养的枝条
• 感染后，取瘤状组织或毛状根继代培养
• 选择转化体这种方法简便、试验周期短，因培养基不与农杆菌直接接触，故污染较小

第56页：基因枪转化系统基因枪

• 3.2基因枪转化系统基因枪（gene gun or particle gun)最初由Sanfort等
• (1987)设计。基因枪法是一种全新的基因导入技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，是目前国际上最先进的基因导入技术

第57页：基本原理：利用火药爆炸或其它动力加速将包

基本原理：利用火药爆炸或其它动力加速将包裹了DNA溶液的金属粒子（如钨粒、金粒等）射入植物细胞，同时也把DNA带入植物细胞

第58页：基因枪转化的特点▲克服了农杆菌介导的寄主

• 1）、基因枪转化的特点▲克服了农杆菌介导的寄主限制
• ▲对靶细胞几乎没有要求
• ▲简化了质粒的构建
• ▲简化了转化方法
• ▲避免了农杆菌污染造成的假阳性
• ▲可以获得持续时间较长的瞬时表达

第59页：基因枪的类型▲火药驱动的基因枪▲电驱动的

2）、基因枪的类型▲火药驱动的基因枪▲电驱动的基因枪▲压缩空气驱动的基因枪基因枪的种类多样，不同的受体植物、不同的组织、器官外植体材料应选用不同类型类型的基因枪

第60页：基因枪转化的主要用途

• 3)、基因枪转化的主要用途
• （1）瞬间表达，测定外源基因结构与产物活性
• （2）介导质粒与线粒体转化（农杆菌T-DNA只能定位到细胞核中）（3）农杆菌T-DNA转化难以成功的顽固性植物的遗传转化
• （4）多基因转移之便利方法，已应用于代谢工程和多基因抗性的获得

第61页：其他基因转化方法植物基因的转移虽然可以用

3.3其他基因转化方法植物基因的转移虽然可以用大肠杆菌质粒、农杆菌质粒、病毒等等作为载体，但是这些方法都不同程度的存在一些限制因素，像农杆菌的质粒对于禾谷类单子叶植物的侵染率很低，难以在基因转移中实际应用

第62页：花粉管通道法微针注射法电击法PEG法转化

花粉管通道法微针注射法电击法PEG法转化方法卵细胞原生质体原生质体原生质体受体材料有性繁殖植物无无无宿主范围无复杂复杂复杂组培条件无无无无嵌合体比例简单复杂复杂简单操作复杂性便宜昂贵昂贵便宜设备要求低低低低工作效率广泛可行可行可行单子叶植物应用

第63页：原理——在高压脉冲条件下

• 原理——在高压脉冲条件下，细胞膜出现短暂的可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，可以导入外源DNA分子。孔道的形成的数量和大小与电场强度有关，关系到摄入DNA的量
• 1)、电激法介导的基因转化

第64页：优点：操作简单

优点：操作简单、基因转化效率高、特别适于瞬间表达的研究缺点：造成原生质体的损伤，使植板效率低，且仪器也昂贵

第65页：显微注射法该法在动物细胞的基因转化中应用

• 2)、显微注射法该法在动物细胞的基因转化中应用的比较成熟
• 它借助于显微注射仪，将外源DNA或mRNA通过机械方法直接注射到受体细胞
• 用于植物基因转化的植物样品有游离细胞、原生质体、分生组织和胚胎组织等多细胞结构

第66页：使用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房

• 使用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中,卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植物
• 胚囊、子房注射法

第67页：组织培养与花药培养（转基因技术与作物）

Ovary-driptransformatio Pollen-tube pathway method:DNA solution was applied tothe cut styles.Ovary-drip method: DNA solution wasapplied to the ovaries with entirelydecapitated styles

第68页：植物的胚囊结构是八核胚囊

• 植物的胚囊结构是八核胚囊，是一个拥有较大空隙的空腔，能够吸入一定的外源DNA溶液
• 卵细胞有一侧没有细胞壁，只有一层质膜，能够吸入外源DNA
• 正常的花粉管进入胚囊后也是在胚囊中破裂，释放出的雄配子DNA也在胚囊中
• 受精后的细胞能正常发育成胚及种子
• 外源DNA溶液注入胚囊后对卵细胞造成一个较大的渗透压，迫使外源DNA进入卵细胞
• 如将外源DNA注入子房中，通过花粉管进入胚珠的通道，能够使外源DNA从子房引入胚囊
• 注入的外源DNA可以是已重组构建的带目的基因及启动子的DNA，因此，导入卵细胞后可以整合到核DNA中并得到表达

第69页：优点：是一种纯粹的物理方法

• 优点
• （1）是一种纯粹的物理方法，适用于各种植物和各种材料，无局限性
• （2）整个操作过程对受体细胞无药物等毒害，有利于转化细胞的生长发育
• （3）转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。缺点：需要精细操作的技术以及低密度培养的基础，注射速度慢,效率低

第70页：花粉管通道法原理

• 3）花粉管通道法原理：将外源DNA片断在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞
• 这一技术可用于任何开花植物

第71页：特点：参与了被转化植物的生殖过程

特点：参与了被转化植物的生殖过程，直接操作于整体植株，避免了传统的基因枪法和土壤农杆菌法转化要求的组织培养技术，转化方法简单，易操作，但双子叶植物都可应用，育种时间较短，具有很强的适用性

第72页：浸泡法介导基因转化植物细胞能够不断地与周

• 4）浸泡法介导基因转化植物细胞能够不断地与周围环境进行物质运输，吸收水分和有机物质，特别是种子萌发吸涨过程中吸收大量水分
• 外源DNA能够随着植物细胞的物质运输一起进入受体细胞

第73页：原理：供试外植体

原理：供试外植体（如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬浮细胞培养物等）直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源DNA基因导入受体细胞并稳定地表达

第74页：转基因植株检测的主要方法

3转基因植株检测的主要方法

第75页：1PCR检测初步确定外源基因是否已整合到

• 3.1.1PCR检测初步确定外源基因是否已整合到受体细胞的染色体。以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到特异性扩增带
• 3.1外源基因整合的检测

第76页：诱变与突变体筛选、分子遗传

Arne Holst-Jensen et al.PCR technology for screening and quantification ofgenetically modified organisms (GMOs). Anal Bioanal Chem (2003) 375 : 985–993A schematic representation of a typical gene construct and four types of PCR-based assaysshowing increasing specificity (fromtop to bottom). H host genomic DNA, P promoterelement, E enhancer element, G gene of interest, T = terminator. The geneconstruct iscomposed of P–T and has been inserted into H

第77页：

第78页：转基因的整合鉴定——PCR检测CK

转基因的整合鉴定——PCR检测CK PT0转化植株CK：非转化对照P：hpt质粒提取转化植株基因组DNA↓设计目的基因特异引物↓以基因组DNA为模板进行PCR扩增特点：只需少量DNA、可快速检测大量样品但易出现假阳性

第79页：Southern杂交检测通过Southe

• 3.1.2.Southern杂交检测通过Southern杂交可以进一步证明外源基因在染色体上的整合以及整合外源基因的拷贝数
• 通过原位杂交可以确定外源基因在染色体上的具体整合位点.Southern杂交实验内容：被检植物DNA提取
• 杂交探针制备
• DNA样品酶切、电泳、变性、印记及杂交
• 杂交结果检出

第80页：转基因的整合鉴定——Southern

转基因的整合鉴定——Southern blot提取转化植株基因组DNA↓DNA电泳并转尼龙膜↓制备目的基因探针↓探针与膜杂交↓显影特点：需要较多DNA样品、灵敏度高pFHBT1NTTT3TT34TT50TT51TT661.8 kb明恢63TT2TT10TT35(引自Tu et al 1998 Plant Biotechnology 15：195-203)Bt基因的整合-Southern杂交分析

第81页：原位杂交Southern印迹杂交可分析外

• 3.1.3.原位杂交Southern印迹杂交可分析外源基因在植物染色体上的整合情况，但对于外源基因在植物染色体上整合位点难以提供可靠证据
• 原位杂交以标记的外源基因为探针，与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，在显微镜下观测
• 主要问题：灵敏性不高
• 易出现非特异性杂交

第82页：

第83页：PCR-Southern杂交检测Sout

• 3.1.4.PCR-Southern杂交检测Southern杂交的灵敏性高，但对样品DNA的纯度要求高，样品需要量大，PCR-Southern杂交检测可弥补这些不足
• 空白对照：无任何DNA模板阳性对照：含外源基因的质粒载体DNA阴性对照：非转化植株基因组DNA

第84页：植物DNAPCR电泳及带型分析变性印迹转

植物DNAPCR电泳及带型分析变性印迹转移杂交与信号检测A、空白对照：无扩增带B、阳性对照：出现一条特异性带，分子量同外源基因C、阴性对照：可能产生非特异性扩增带D、转化植株：产生与阳性对照相同的特异性带

第85页：外源基因表达的检测通过Northern杂

• 3.2.外源基因表达的检测通过Northern杂交、RT-PCR等可以证明外源基因是否已在受体细胞内转录
• 通过Western印迹可以证明外源基因是否能在受体细胞中得到翻译
• 检测特异mRNA：Northern杂交检测特异蛋白质表达：生化反应检测法
• 免疫学检测法（如Western杂交等）
• 生物学活性检测

第86页：报告基因检测

3.2.1报告基因检测：可用简单的生化方法或免疫学方法

第87页：GFP Sub-cellular

GFP Sub-cellular location

第88页：原生质体融合、品质性状

• AtCLCa resides in thetonoplast. a, Transientexpression of AtCLCa–GFPfusion proteins inprotoplasts. Laser-scanningimages of GFPfluorescence (left),transmitted light (centre)and merge of both (right)
• scale bars correspond to 16mm. b, Western blotanalysis of protoplast andvacuolar membranesfromwild-type, clca-1 (ref.9) and clca-2 plants.A. De Angeli,et al.The nitrate/proton antiporter AtCLCa mediates nitrateaccumulation in plant vacuoles.Nature.2006,Vol442:939-943

第89页：外源基因表达的分子检测

• 3.2.2.外源基因表达的分子检测
• 3.2.2.1.mRNA表达水平的检测
• 1)Northern杂交：通过细胞总RNA或poly（A）mRNA与探针的分子杂交分析转基因植株中外源基因的转录。分为斑点杂交和印迹杂交

第90页：2）RT-PCR（reverse

2）RT-PCR（reverse transcribed PCR）检测：以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增，如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增带，则表明外源基因实现了转录

第91页：分子遗传（转基因技术与作物）

The four-step workflow for genetically modified organism (GMO)analysis using the ready-to-use multitarget analytical system3）Real time PCR

第92页：杂交与授粉（转基因技术与作物）

4）In situ Hybridization

第93页：品质性状（转基因技术与作物）

3.2.2.2.Detection of protein在证明外源基因表达出特异的mRNA后，进一步证明表达出的mRNA能翻译成特异蛋白质。若外源基因表达产物是一种酶，则可测定转化植株中该酶的活性；若外源基因表达产物不是酶，就采用免疫学方法检测

第94页：植物蛋白质提取SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳

• 植物蛋白质提取SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳蛋白质条带印迹探针（抗体，一抗）制备封闭（淬灭，去背景）两步抗体反应显色封闭后加入特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗，通过二抗上标记化合物的性质进行检测
• 由目的蛋白制成的抗血清或单克隆抗体

第95页：Bt

Bt基因的表达-western杂交分析(引自Tu et al 2000 Nature/Biotechnology 18: 1101-1104)cry1Abtoxin 10ngcry1Abtoxin 2ngNT1 23456 7TT51-1M (kDa)66.046.030.060 kDaWestern杂交

第96页：ELISA

ELISA

第97页：作物产量、分子遗传

Kamle S, Ali S. Genetically modified crops: Detectionstrategies and biosafety issues.Gene 522 (2013) 123–132

第98页：

第99页：外源基因表达的表型鉴定

• 3.3.外源基因表达的表型鉴定
• 3.3.1选择标记的鉴定转hpt基因植株非转化对照植株Hm浸泡筛选

第100页：明恢63/Bt明恢63

明恢63/Bt明恢63 control3.3.2.目标性状鉴定

第101页：Peter Hedden

Peter Hedden and Andrew L. Phillips(2000)

第102页：转基因育种、人口增长与粮食安全

• References
• Hossein Azadi，Peter Ho.Genetically modified and organic crops indeveloping countries: A review of options for food security.Biotechnology Advances 28 (2010) 160–168.
• Philippe Vain.Thirty years of plant transformation technologyDevelopment.Plant Biotechnology Journal,(2007) ,5 , pp. 000–000