12 第12章 植物细胞工程与育种.pptx

第1页：第十二章植物细胞工程与作物育种

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第2页：植物细胞工程

• 植物细胞工程（plant cell engineering）是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科
• 它以细胞为基本单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程

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第4页：组织培养与花药培养（植物细胞工程与作）

Control of in vitro cultureCytokini Auxi Leaf stripAdventitiousShootRootCallus

第5页：体细胞克隆变异somaclonalvar

• 体细胞克隆变异somaclonalvariation）指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异。第一节细胞和组织培养与作物育种
• 1.体细胞克隆变异及其育种利用

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第7页：体细胞克隆变异的遗传基础

• 1.1体细胞克隆变异的遗传基础
• 1）染色体数目变异最多见的是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素引起。二倍体变异的频率随培养时间的延长而降低，四倍体变异的频率却随培养时间的延长而增加

第8页：染色体结构变异染色体结构变异是体细胞克隆

• 2）染色体结构变异染色体结构变异是体细胞克隆变异的主要来源，最重要的是染色体缺失、倒位、重复和异位
• 很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的存在

第9页：点突变自发突变

• 3）点突变自发突变，很多通过细胞筛选获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类
• 诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理

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第11页：转座因子是造成体细胞突变的原因之一

• 转座因子是造成体细胞突变的原因之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控
• Tos 17Miyo et al,2012,Plant Cell Physiol.4）转座因子

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第13页：表观遗传学修饰

（5）表观遗传学修饰

第14页：各种类型的突变体:抗性突变体:抗病

各种类型的突变体

抗性突变体:抗病、耐盐、抗重金属

形态性状突变体

矮化性、叶型

不育性

核基因的突变

产量和品质性状的改变等

产量和品质性状的改变等

第15页：突变体的筛选将外植体

• 1.2突变体的筛选将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理(如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步的工作)
• 剂量和处理时间应根据具体试验确定

第16页：在突变体筛选中常采用一步筛选法和多步筛选

• 在突变体筛选中常采用一步筛选法和多步筛选法
• 一步筛选法是将培养物接种在含有最低全部致死剂量的培养基上，表现出生长的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上

第17页：多步筛选法首先使用半致死剂量对细胞进行筛

• 多步筛选法首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜培养基上
• 在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长的快，通过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超过最低全部致死浓度时也能旺盛生长的细胞系

第18页：筛选的材料对象可以是原生质体

• 筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物
• 利用原生质体进行抗性筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但操作困难
• 利用愈伤块筛选最简单，但愈伤块里的个细胞不能均等地接触抑制剂，筛选结果bu可靠

第19页：悬浮细胞筛选细胞接触选择剂较均匀

• 悬浮细胞筛选细胞接触选择剂较均匀，但存在一定的操作复杂性
• 花粉/小孢子培养物用于突变体筛选突变体很容易表现出来，也很易纯合

第20页：为了帮助保护您的隐私

• 为了帮助保护您的隐私，PowerPoint 已阻止自动下载此图片。优良品种↓细胞培养R0↓R1群体↓改良的体细胞克隆确定遗传方式↓田间实验遗传稳定性测试↓多点田间实验育成新品系↓继续田间实验，种子富集区域试验↓审定↓投入生产图利用体细胞克隆变异育种的技术路线
• 1.3作物改良上的应用Chen et al, An Efficient RiceMutagenesis System Basedon Suspension-CulturedCells.2013,JIPB

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第22页：单倍体细胞培养花药培养

• 2.1单倍体细胞培养花药培养（anther culture）是指在获得单倍体的一种技术
• anther culture–easiest and simplestpollen (microspore) culture–advantages-less competition among microspores-no diploid anther walls-greater potential haploid plant production2单倍体细胞培养及育种利用

第23页：组织培养与花药培养（植物细胞工程与作）

Anther/Microspore Culture

第24页：后代的快速纯合在异花授粉作物中

• （1）后代的快速纯合在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种
• （2）提高选择效率如某一性状受一对基因控制，F1采用花药或花粉培养，产生的后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提高一倍
• 2.2单倍体育种的优点

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第26页：排除杂种优势对后代选择的干扰采用DH群体

• （3）排除杂种优势对后代选择的干扰采用DH群体进行选择育种，各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能代表真实变异
• （4）遗传研究的良好材料体系单倍体是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群构建、QTL估计及定位等数量遗传学的良好材料
• 2.2.单倍体育种的优点

第27页：突变体的筛选由于单倍体的各基因均处于纯合

• （5）突变体的筛选由于单倍体的各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率
• 2.2单倍体育种的优点

第28页：小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子

• 小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒
• 在离体培养条件下，花粉的正常发育途径受到抑制
• Bajaj, Y.P.S. 1983. In D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V.Ammirato, and Y. Yamada (eds.), Handbook of Plant CellCulture. Volume 1. Techniques for Propagation andBreeding. MacMillan, New York. p. 228-287.2.3离体培养条件下的小孢子发育

第29页：组织培养与花药培养、分子遗传

Similar nuclei3 to 5°CMicrosporeEmbryo3 to 5°CGenerativeVegetative（4）花蕾和花药的预处理对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。TobaccoDays i Culture5°C for 72 hControl003712510% Pollenw/identical nuclei

第30页：影响花药培养的因素

• 2.4影响花药培养的因素
• 1）供体植株的生长条件供体植株的生长条件对培养效果有重要影响
• 2）供体植株的年龄供体植株对培养效果也有一定影响.3）花粉发育时期用于培养的花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异

第31页：培养基多数情况下

• （5）培养基多数情况下，MS、N6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用的较多
• (6）培养条件多数植物在25℃下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸苔属，在高温35℃下处理几天，然后进入25℃培养能收到最好效果。花药培养一般在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养

第32页：花粉（小孢子）培养花粉培养是以单个花粉粒

• 2.5花粉（小孢子）培养花粉培养是以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术
• 其优点在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体

第33页：植物细胞工程与作物育种要点

• 2.6单倍体诱导中存在的问题
• 1)能形成有活力胚的花药百分率很低
• 2)导致胚败育
• 3)在产生单倍体的同时产生二倍体或四倍体
• 4)培养中小孢子he二倍体组织分裂
• 5)白化苗难以避免
• 6)在混倍性的材料中很难分离出单倍体

第34页：单倍体细胞培养与植物育种单倍体是高度不育

• 2.7单倍体细胞培养与植物育种单倍体是高度不育的，需要进行加倍处理才能应用
• 秋水仙素是常用的染色体加倍药剂，可以用1%的秋水仙素对正处于对数生长期的悬浮细胞进行处理，一般24h左右
• 也可在固体培养基中加适当浓度的秋水仙素

第35页：A品种×B品种↓F1杂交种↓小孢子培养或

A品种×B品种↓F1杂交种↓小孢子培养或花药培养单倍体培养↓染色体加倍重组纯合系↓选择重组了A和B品种优点的纯系↓自交、田间测试遗传稳定性测试↓田间测试新品系→→→→→确定遗传基础↓品种亲本↓-------------------------------杂交推广利用↓杂种优势利用图单倍体细胞培养及育种技术

第36页：组织培养与花药培养、抗病虫性

• Anther and microspore culture
• Uses in plant breeding
• group 1 (asparagus, maize, rubber)
• DHs produced with low efficiency
• goals-asparagus all male F1hybrids
• maize DHs are screened like other inbreds
• group 2 (wheat, melons, peppers)
• rel. large no. of DHs can be produced
• goals–genetic maps; separating & IDingdisease resistance genes (e.g., CMV resistancein pepper)

第37页：

第38页：组织培养与花药培养、育种与选择

• Anther and microspore culture
• Uses in plant breeding
• group 3 (rapeseed, barley, rice)–DH lineseasy
• rice–lines used to develop varieties, esp.japonica subspecies
• rapeseed–pedigree selection programs andparental lines for F1hybrid varieties
• barley–winter barley varieties use microsporeculture, spring barley varieties use thebulbosum method (to be discussed later)

第39页：植物胚胎培养

• 植物胚胎培养（embryo culture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术。植物幼胚和胚珠培养是植物远缘杂交育种的重要辅助手段
• 3幼胚培养与远缘杂交育种

第40页：

第41页：需要较少的空间就能保存大量的无性系

• 1)需要较少的空间就能保存大量的无性系
• 2)保存过程中可避免病虫害的侵袭
• 3)长期保存
• 4)保存多种类型材料,愈伤组织、茎尖、幼胚、花粉形成的单倍体愈伤组织等
• 4.种质的长期保存
• 4.1.优点

第42页：缓慢生长保存法和超低温保存法

• 缓慢生长保存法和超低温保存法。缓慢生长法包括降低培养温度、减少氧气含量、将组培材料脱水干燥等。超低温保存法是在超低温情况下，使生物的代谢和衰老过程大大减慢甚至完全停止
• 4.2保存的方法

第43页：超低温通常指低于-80℃的低温

超低温通常指低于-80℃的低温，保存介质或容器有干冰（-79℃）、超低温冰箱（-80—150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽相（-140℃）等，其中液氮最常用

第44页：病毒在植物体内的分布是不均匀的

• 病毒在植物体内的分布是不均匀的，顶端分生组织一般不带毒，植物茎尖脱毒在无性繁殖(如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等)作物的提纯复壮中有很重要的应用价值。大多数果树和观赏植物是高度杂合的，它们的种子后代无法与原品种相同，如要保持原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖
• 5脱毒及繁殖重要品种或材料

第45页：植物材料的快速繁殖主要是通过诱导茎芽形成

• 植物材料的快速繁殖主要是通过诱导茎芽形成实现的，通过两种途径使茎芽增殖:一种是通过愈伤组织诱导丛生芽形成，然后分株培养，便可获得大量遗传上基本一致的无性系
• 另一种是诱导茎尖或不定芽萌发或形成丛生芽也可达到快速繁殖的目的

第46页：组织培养与花药培养、分子遗传

In vitro somatic embryogenesis ofEuphorbia pulcherrima

第47页：组织培养与花药培养、杂交与授粉

Somatic embryogenesis in Rosahybrida cv. Landora

第48页：人工种子：人工种子的生产

• 人工种子（artificial seeds）是指将细胞培养所产生的体细胞胚或其类似物，经过有机化合物的包埋而形成的能在适宜条件发芽的类似于天然植物种子的颗粒体。在固定杂种优势、快速繁殖良种和不育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都有潜在价值。它通常由三部分组成：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮
• 6人工种子的生产

第49页：植物原生质体

• 植物原生质体（protoplast）是一个没有壁的细胞，原生质体的结构变得很脆弱，很容易破裂,使得原生质体的操作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞的全能性，具有了同正常细胞一样的特性。第
• 2节植物原生质体培养和体细胞杂交

第50页：原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受

• 原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，其先决条件是要有一个合适的渗透压
• 1原生质体的分离

第51页：分离方法分离原生质体的方法一般有机械分离

• 1.1分离方法分离原生质体的方法一般有机械分离和酶法分离两种
• 机械法分离先对材料进行质壁分离处理，然后切割释放出少量的不受损伤的原生质体
• 用这一方法仅能从液泡很大的材料中获得原生质体，而不能应用于分生细胞

第52页：酶法分离原生质体是目前常用的方法

• 酶法分离原生质体是目前常用的方法，可分为一步法和二步法
• 一步法是将果胶酶（pectinase）和纤维素酶（celluluse）等混合处理材料，直接分离获得原生质体
• 二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体

第53页：原生质体融合（植物细胞工程与作）

Protoplasts Isolation and Culture

第54页：影响原生质体分离的因素

• 1.2影响原生质体分离的因素
• 1）材料来源叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很容易获得而且遗传上较一致，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物

第55页：渗透压原生质体分离之前必须确定一个适合的

• 2）渗透压原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压
• 在这种渗透压下，原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤

第56页：酶植物细胞壁是一个复杂结构

• 3）酶植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素组成，需要一定的酶组成才能降解它
• 广泛使用的商品酶制剂可以从很多公司购买

第57页：分离培养基Ca2+对原生质体的产量和稳定

• 4）分离培养基Ca2+对原生质体的产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁的主要成分，同时能稳定膜结构
• 另外，Mg2+、PO43-对于原生质体活力的保持也有重要作用，所以分离原生质体的培养基中除酶外，一般含这些离子

第58页：培养条件酶处理时的温度和pH最重要

• 5）培养条件酶处理时的温度和pH最重要。PH使用范围为
• 4.8-7.2，可是，高pH（大于
• 6.0）一般有利于原生质体的生存，可能是高pH降低了细胞壁降解时产生的有害酶活性和存在于分离培养基中的毒性物质的活性。为了防止pH的变化，常加入MES[2（N-morpholino）-ethanesulfonic acid]。这是一种缓冲剂，一般使用量为3mM

第59页：组织前处理高渗前处理

6）组织前处理高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果

第60页：原生质体的收集

• 1.3原生质体的收集、纯化和活力测定原生质体酶解完成后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，收集滤液，低速离心，去上清液
• 用含有酶解液同样渗透剂的无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，反复几次，便完成原生质体的洗涤工作

第61页：原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法

• 原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，具体操作方法可参考专业书籍
• 用Evan’s blue或FDA测定原生质体活力，以确定原生质体的分离效果

第62页：平板培养液体浅层培养悬浮培养液-固双层培

• 平板培养液体浅层培养悬浮培养液-固双层培养琼脂糖包埋看护培养
• 2原生质体培养
• 2.1.培养方法

第63页：原生质体培养一般在暗处进行

• 1)原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生
• 2)原生质体培养一般在22-25℃进行，高、低温都有害
• 3)培养基无机营养和有机营养组成都对培养效果有显著影响
• 4)选择适当的渗透压对于获得大量原生质体并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇调节渗透压
• 5)生长素对于培养早期壁的形成是需要的，最常用的是2，4-D，有时需要生长素与分裂素结合使用
• 2.2.培养条件

第64页：细胞融合

3细胞融合（体细胞杂交）原生质体融合技术是实现基因重组的一条途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型，有效地拓宽了植物育种的资源

第65页：原生质体融合、倍性与染色体

• Uses for Protoplast Fusion
• Combine two complete genomes
• Another way to create allopolyploids
• Partial genome transfer
• Exchange single or few traits between species
• May or may not require ionizing radiation
• Genetic engineering
• Micro-injection, electroporation, Agrobacterium
• Transfer of organelles
• Unique to protoplast fusion
• The transfer of mitochondria and/or chloroplastsbetween species

第66页：NaNO3处理诱发融合由NaNO3诱导的

• 1）NaNO3处理诱发融合由NaNO3诱导的可重复、控制的离体原生质体融合。这种融合的机制一般认为是Na+造成了膜电位的改变
• 3.1融合方法分离的原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以一般要在诱发条件下才能发生融合

第67页：高pH—高浓度钙离子处理烟草叶肉原生质体

• 2）高pH—高浓度钙离子处理烟草叶肉原生质体在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）条件下能很快诱发融合（37℃），但融合频率不很高，高pH也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合
• 高Ca2+高pH诱发融合的机制是改变了膜位及膜的物理结构

第68页：PEG（聚乙二醇）处理PEG诱导不仅融合

• 3）PEG（聚乙二醇）处理PEG诱导不仅融合频率高，而且使二核融合频率增加且无特异性
• 影响原生质体聚集及随后融合的因子很多，如PEG的分子量及浓度、原生质体的材料来源、分离原生质体时使用的酶制剂、离子种类和浓度、融合温度等

第69页：电融合当两个原生质体处于接触状态时

• 4）电融合当两个原生质体处于接触状态时，给一个5—12μamp的电流持续1—5s，原生质体首先受刺激，然后马上融合
• 应用电融合时，原生质体轻微收缩，表明其膜状态有一个短暂的变化

第70页：电融合包括两个步骤

电融合包括两个步骤

①电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链

②融合

由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合

第71页：

第72页：融合方式原生质体融合有两种融合方式

• 3.2、融合方式原生质体融合有两种融合方式，即对称融合和非对称融合
• 这两种融合方式都能产生三种类型的杂种：综合了双亲全部遗传物质的对称杂种
• 部分遗传物质发生丢失的非对称杂种
• 只具有融合双亲一方核遗传物质的胞质杂种

第73页：对称融合即双亲的核质组装在一起的融合

• 对称融合即双亲的核质组装在一起的融合
• 非对称融合指在融合前对一方亲本原生质体施加一定的处理，纯化其细胞质，再和另一方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞质杂种

第74页：对供体进行处理的方法有多种：射线

• 对供体进行处理的方法有多种：射线（X、γ和紫外线）辐射原生质体
• 限制性内切酶处理原生质体
• 纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体，其中射线的作用最好

第75页：

第76页：形态互补利用两种原生质体形态色泽上的差异

• 1）形态互补利用两种原生质体形态色泽上的差异，在融合处理后，分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约有2—3个原生质体。在显微镜下可以找出异源融合体并标定位置
• 3.3、杂种细胞的筛选

第77页：遗传互补利用两个白化突变互补可以进行筛选

• 2）遗传互补利用两个白化突变互补可以进行筛选
• 单个隐性突变性状（如白化）可以与某一形态性状结合起来用于筛选
• 然后再结合形态及染色体数目的检查就可进一步证实

第78页：代谢互补利用两种营养缺陷型或两种抗性突变

3）代谢互补利用两种营养缺陷型或两种抗性突变体的原生质体进行融合，在同时缺陷两种物质或同时含有两种有害物质的培养基上筛选杂种细胞，能生长的细胞团可以初步认为由杂种细胞形成

第79页：生长互补Carlson等

• 4）生长互补Carlson等
• （1972）发现，双亲原生质体的生长需要外源生长激素，而由双亲原生质体融合后形成对生长激素自主的杂种细胞，能在无外源生长激素的培养基上生长。用这一特点选出了粉蓝烟草与郎氏烟草的体细胞杂种

第80页：原生质体融合、杂交与授粉

Possible Result of Fusion of TwoGenetically Different Protoplasts= chloroplast= mitochondria= nucleusFusionheterokaryoncybridcybridhybridhybrid

第81页：杂种的鉴定通过杂种细胞筛选获得的再生植株

• 3.4、杂种的鉴定通过杂种细胞筛选获得的再生植株不一定是杂种植株，应经过进一步验证才能确定
• 有多种鉴定杂种方法
• 根据形态性状判断是最简单的方法，杂种植株的叶形通常介于双亲之间，叶面积居中，花器官（花冠长度、颜色、形态等）带有双亲性状

第82页：染色体计数是细胞学鉴定体细胞杂种的基本方

• 染色体计数是细胞学鉴定体细胞杂种的基本方法，但杂种染色体数目不一定正好是双亲染色体数目之和，常出现混倍体
• 染色体数目的变化可能来自多细胞融合、培养过程中的细胞学变异和核与质基因融合后的不亲和

第83页：常用的生化鉴定方法是同工酶

• 常用的生化鉴定方法是同工酶，融合后形成的杂种应该表现出双亲的同工酶带型
• 分子标记鉴定可以较准确地反映融合是否成功，RAPD、RFLP、AFLP是常用的鉴定杂种的分子标记

第84页：细胞融合与作物育种利用细胞融合可以克服远

3.5、细胞融合与作物育种利用细胞融合可以克服远缘杂交的不亲和性，创造种间、属间杂种，为作物育种提供新材料

第85页：植物细胞融合TomatoPotato+P

植物细胞融合TomatoPotato+Pomato薯茄

第86页：但是，细胞融合获得的杂种一般在生产上难以

但是，细胞融合获得的杂种一般在生产上难以直接利用，但这一技术可以为作物育种创造自然界不存在的新资源，对作物育种种质资源的拓展有十分重要的意义