02 第一章 蛋白质.ppt

第1页：第一章蛋白质封面

蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。第一章蛋白质(Protein)

第2页：蛋白质的定义与重要性

第一节概述一、蛋白质的定义蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断

第3页：蛋白质是生物体的重要成分

• 1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分蛋白质占干重人体中（中年人）人体45% 水55%细菌50%~80% 蛋白质19%真菌14%~52% 脂肪19%酵母菌14%~50% 糖类＜1%白地菌50% 无机盐7%2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者
• （2）调节作用(多肽类激素)
• （5）免疫保护作用(干扰素)
• （6）接受、传递信息的受体

第4页：蛋白质的元素组成

蛋白质的元素组成：下表列出相关数据。

第5页：凯氏定氮法测蛋白质含量

• 氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量
• 蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故：
• 蛋白质含量=氮的量×100/16×6.25

第6页：蛋白质含量测定与化学组成

除了上法外，还有紫外比色法双缩脲法Folin—酚考马斯亮兰G—250比色法（条件：蛋白质必须是可溶的）2.化学组成（两种类型）单纯蛋白质：水解为α-氨基酸结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基

第7页：氨基酸的结构特点

• 第二节氨基酸化学一、氨基酸的结构与分类
• (2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。1.氨基酸的结构氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：
• (1). 与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸COOHH2N CH α-碳原子基团R R基团α-氨基酸基本结构通式

第8页：常见氨基酸的分类

• 2.常见氨基酸的分类中性AA
• （1）按R基团的酸碱性分酸性AA碱性AA
• （2）按R基团的疏水性R基团AA电性质分不带电荷极性R基团的AA带电荷R基团的AA脂肪族A
• （3）按R基团的化学结构分芳香族AA杂环族AA

第9页：构成蛋白质的20种氨基酸

3.构成蛋白质的20种氨基酸

第10页：人体所需的八种必需氨基酸

人体所需的八种必需氨基酸：下表列出相关数据。

原文将 Thr 标注为「酪氨酸」，按标准值修正为「苏氨酸」（Threonine）；酪氨酸缩写应为 Tyr。婴儿时期还需精氨酸、组氨酸，早产儿还需色氨酸、半胱氨酸。

第11页：

第12页：氨基酸的一般物理性质

• 二.氨基酸的重要理化性质1.一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异
• (1)溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。
• (2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。
• (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。
• (4)旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。
• (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。

第13页：芳香族氨基酸的紫外吸收

芳香族氨基酸的紫外吸收：下表列出相关数据。

构成蛋白质的20种氨基酸在远紫外区（<220nm）均有吸收，近紫外区仅此三种有吸收能力。

第14页：氨基酸的两性离解

氨基酸的两性离解：下表列出相关数据。

第15页：氨基酸的等电点

• 3.氨基酸的等电点当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI = (pK’1 + pK’2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’R-COO-)/2 硷性氨基酸：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/24.氨基酸的化学性质
• (1)与茚三酮的反应（颜色反应）

第16页：氨基酸与茚三酮的反应

氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。

第17页：茚三酮反应要点与应用

反应要点A.该反应由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D. 测定范围：0.5~50µg/mlE.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。(2)与甲醛反应

第18页：氨基酸与甲醛的反应

• 反应特点A.为α-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高
• （12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。
• (3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应

第19页：氨基酸与DNFB的反应

• 反应特点A.为α-NH2的反应B.氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的ε-NH
• 2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与α-DNP氨基酸区分和分离

第20页：N-末端测定与Sanger法

• 首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.
• 由Edman于1950年首先提出
• 为α-NH2的反应
• 用于N末端分析，又称Edman降解法肽分子与DNFB反应，得DNP-肽层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应

第21页：Edman降解法

Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

第22页：Edman降解反应步骤

• 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽
• 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少
• 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸
• 分离PTH-氨基酸
• 层析法鉴定
• Edman降解法的改进方法---DNS-Edman降解法
• 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸
• 原理DNFB法相同
• 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定
• 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍
• 可用于微量氨基酸的定量

第23页：DNS-Edman降解法

• 用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链
• 灵敏度提高，能连续测定。
• 多肽顺序自动分析仪
• 样品最低用量可在5pmol（5）与荧光胺的反应
• α-NH2的反应
• 氨基酸定量（6）与5,5’-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应
• -SH的反应
• 测定细胞游离-SH的含量（7）其他反应
• 成盐、成酯、成肽、脱羧反应

第24页：肽与肽键的概念

• 第三节蛋白质的分子结构
• 蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。
• 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。
• 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大一.基本问题---肽
• 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。
• 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。1.多肽

第25页：多肽链的氨基酸顺序

• 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序
• 通常在多肽链的一端含有一个游离的
• -氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的
• -羧基，称为羧基端或C-端。
• 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

第26页：肽键的结构特点

• 2.肽键
• 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。
• 组成肽键的原子处于同一平面。
• 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。
• 在大多数情况下，以反式结构存在。

第27页：天然存在的活性多肽

• 3.天然存在的重要多肽
• 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。
• 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。
• 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

第28页：脑啡肽的结构式

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽Leu-脑啡肽

第29页：蛋白质的一级结构

• 二.蛋白质的一级结构1. 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括：
• (1)组成蛋白质的多肽链数目.
• (2)多肽链的氨基酸顺序，
• (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。2.蛋白质的一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
• (1) 测定蛋白质的一级结构的要求

第30页：一级结构测定的要求

• A.A.样品必需纯（>97%以上）；B.B.知道蛋白质的分子量；C.C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
• (2)测定步骤①多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).

第31页：多肽链拆分与二硫键断裂

• 测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
• 二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的
• -巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

第32页：末端氨基酸的测定

• 巯基的保护
• 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；
• 分析多肽链的N-末端和C-末端
• 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：

第33页：DNFB法与丹磺酰氯法

A.二硝基氟苯（DNFB）法B.丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。

第34页：肼解法

C.肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。

第35页：氨肽酶法与羧肽酶法

D.氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。E.羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。⑥多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：

第36页：多肽链的选择性降解

A.酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶B.化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。

第37页：蛋白质的二级结构

• 测定每个肽段的氨基酸顺序。
• 确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
• 确定原多肽链重二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。三.蛋白质的空间结构1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有
• -螺旋、
• -折叠、
• -转角。(1).
• -螺旋

第38页：α-螺旋的结构

• -螺旋中肽平面的键长和键角一定,肽键的原子排列呈反式构型,相邻的肽平面构成两面角.
• 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.
• 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。
• 蛋白质分子为右手
• -螺旋。左手和右手螺旋

第39页：β-折叠的结构

• （2）
• -折叠
• -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。
• -折叠中，
• -碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.
• -折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。
• -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。

第40页：β-转角与自由回转

• （3）-转角在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基．弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的–N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。
• （４）自由回转没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同．分两类：①紧密环②连接条带

第41页：超二级结构

• ２．超二级结构和结构域
• （１）超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构：α α；ββ；βαβ；βββ．超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．α αβββαβ

第42页：蛋白质的结构域

• （２）结构域对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。
• 结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。
• 结构域一般由100~200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的．
• 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．
• 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。
• 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性．

第43页：结构域与三级结构

• 结构域与功能域的关系：
• 有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是．
• 包含一个但通常是多个结构域３．蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布．一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面．

第44页：蛋白质的四级结构

• ４．蛋白质的四级结构许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：
• 球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基
• 两条α链，两条β链，α2β2
• α 链：141个残基；β链：146个残基
• 分子量65 000
• 含四个血红素辅基
• 亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部

第45页：蛋白质结构层次图

三．蛋白质分子中的共价键与次级键一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构

第46页：维系各级结构的化学键

• 维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键
• 维系蛋白质分子的二级结构：氢键
• 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键
• 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d 范德华力e二硫键f 酯键

第47页：次级键的作用特点

• 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键
• 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大
• 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要
• 盐键数量小
• 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力

第48页：一级结构与功能的关系

• 第四节蛋白质分子结构与功能的关系一.蛋白质一级结构与功能的关系研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。例1 镰刀形贫血病
• 患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）
• 它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于β链的N-末端第6位残基发生了变化
• （Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基
• 使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血
• 这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性

第49页：蛋白质原的激活

• 例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原
• 前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.
• 信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。
• 胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.

第50页：同源蛋白与不变残基

• 例3 同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C
• 60 个物种中，有27 个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.
• 可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.

第51页：蛋白质的别构效应

• 黄色：不变残基（invariable residues）蓝色：保守氨基酸（conservative residues）未标记：可变残基（variable residues）二.蛋白质的构象与功能的关系别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式.例：血红蛋白的别构效应
• 一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变
• 进而引起另三个亚基的构象改变
• 整个分子构象改变
• 与氧的结合能力增加

第52页：蛋白质分子量的测定

• 第五节蛋白质的性质一.蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒）．蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量
• 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量
• 然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：
• 最小相对分子质量＝（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量
• 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。2.超离心法
• 在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动
• 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度
• 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关

第53页：沉降系数与凝胶过滤法

• 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。
• 一个S单位，为1×10-13秒
• 相对分子质量越大，S值越大
• 蛋白质的沉降系数：1～200S由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D〔1－iρ〕R：气体常数T：绝对温度D：扩散系数ρ：溶剂的密度3.凝胶过滤法
• 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构
• 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外
• 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大
• 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex

第54页：SDS-PAGE测分子量

• 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕
• 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线
• 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕
• 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
• SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂
• 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）
• 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理
• 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物
• 不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）
• 不同蛋白质分子具有相似的构象
• 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图
• 测出待测样品的迁移率
• 从标准曲线上查出样品的相对分子质量

第55页：电泳迁移率与蛋白质电泳

• 影响迁移率的主要因素
• 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力〔主要因素〕
• 凝胶的浓度和交联度
• 同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小
• 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差）
• 此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量二. 蛋白质的两性离解和电泳现象
• 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。
• 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。

第56页：蛋白质的胶体性质

• 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。三.蛋白质的胶体性质
• 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。
• 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。四.蛋白质的沉淀作用
• 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。
• 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质
• 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。

第57页：可逆沉淀与不可逆沉淀

• (1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
• (2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。
• (3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.不可逆沉淀
• (1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
• (2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。
• (3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。五.蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.

第58页：蛋白质的变性

变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。

第59页：蛋白质的紫外吸收与双缩脲反应

• 六.蛋白质的紫外吸收
• 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
• 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。
• 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。七.蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应：
• 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物
• 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应
• 肽键的反应，肽键越多颜色越深
• 受蛋白质特异性影响小
• 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度

第60页：米伦氏乙醛酸坂口反应

• 2.米伦氏反应
• 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）
• 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物
• 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应
• 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成
• 色氨酸的反应（吲哚环的反应）
• 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸
• 明胶中不含色氨酸4.坂口反应
• 精氨酸的反应（胍基的反应）
• 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物
• 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸
• 定量测定精氨酸

第61页：福林试剂与考马斯亮蓝法

• 5.福林试剂反应
• 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）
• 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸
• 与双缩脲法结合---Lowry法
• 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应
• 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物
• 灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应
• 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应
• 生成黄色化合物
• 指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250
• 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色
• 与蛋白的亲和力强，灵敏度高
• 1---1000微克/毫升

第62页：蛋白质的分类：外形与简单蛋白

• 第六节蛋白质的分类一. 依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质：（globular protein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrous protein)分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。二.依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为1.简单蛋白(simple protein)：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。
• （1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。
• （2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。
• （3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。
• （4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。

第63页：结合蛋白的种类

• 2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成
• （1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。
• （2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。
• （3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。
• （4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。
• （5）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。
• （6）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。

第64页：第一章本章小结

• 本章小节1.蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白2.蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定3.二十种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符、单字缩写符）4.氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应5.蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定6.蛋白质的空间结构：二级结构单元（
• -螺旋、
• -折叠、
• -转角、自由回转）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系7.蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应8.蛋白质的分类：按外形及组成分类