第1页：酶免疫技术内容提要
- 第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点
- 酶和酶作用底物
- 酶标记抗体或抗原
- 固相载体
第2页：酶免疫技术内容提要
- 第二节酶免疫技术的分类
- 均相酶免疫测定
- 非均相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验
- 基本原理
- 方法类型及反应原理思考题小结
第3页：放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三
放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术
第4页：第一节酶免疫技术的特点
第一节酶免疫技术的特点
第5页：•主要试剂
- 主要试剂:酶标记的抗体或抗原
- 酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性原理及特点
第6页：特点
- 特点：
- 灵敏度高、特异性强、准确性好
- 酶标记试剂能够较长时间保持稳定
- 操作简便、对环境没有污染。
- 易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：
- 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应
- 酶对底物的显色反应
- 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析原理及特点
第7页：酶和酶作用底物
- 标记酶的要求
- 标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉一、酶和酶作用底物
第8页：辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶
辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最为广泛的标记用酶常用酶酶和酶作用底物
第9页：碱性磷酸酶（AP）菌源性AP 肠粘膜
碱性磷酸酶（AP）菌源性AP 肠粘膜APβ–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫测定常用酶酶和酶作用底物
第10页：底物
HRP的底物DH2+H2O2→ → → D+2H2OHRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高常用底物酶和酶作用底物
第11页：HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基
HRP的常见底物邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS常用底物酶和酶作用底物
第12页：OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后
OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物酶和酶作用底物
第13页：AP的底物β-Gal的底物对-硝基苯
AP的底物β-Gal的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP ）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG ）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。常用底物酶和酶作用底物
第14页：酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物二、酶标记抗体或抗原
第15页：抗原要求纯度高，抗原性完整抗体需
- 抗原要求纯度高，抗原性完整
- 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。制备方法要求酶标记抗体或抗原
第16页：制备方法要求技术方法简单、产率高，重
制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原
第17页：制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于H
制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原戊二醛交联法酶标记抗体或抗原
第18页：戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同
戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。酶标记抗体或抗原
第19页：纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中
纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原
第20页：固相载体
- 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法
- 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面三、固相载体
第21页：要求•结合抗体或抗原的容量大•抗体或
- 要求
- 结合抗体或抗原的容量大
- 抗体或抗原牢固地固定在其表面
- 不影响免疫反应性
- 利于反应充分进行
- 固相方法简便易行，快速经济种类
- 塑料制品
- 微颗粒
- 膜载体固相载体
第22页：将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5
将抗原或抗体结合于固相载体用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附包被coating封闭blocking包被与封闭
第23页：第二节酶免疫技术的分类
第二节酶免疫技术分类
第24页：酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非
酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量
第25页：均相酶免疫测定
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理一、均相酶免疫测定
第26页：最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技
最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析CEDIAcloned enzyme donor immunoassay均相酶免疫测定
第27页：EMIT示意图
EMIT示意图
第28页：CEDIA示意图
CEDIA示意图
第29页：非均相酶免疫测定
- 分类
- 分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定
第30页：第三节酶联免疫吸附试验
第三节酶联免疫吸附试验
第31页：基本原理
底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理
第32页：方法类型及反应原理
固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物三个必要试剂二、方法类型及反应原理
第33页：双抗体夹心法方法
- 双抗体夹心法
- 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色
- 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原的方法
第34页：
第35页：1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标
- 已知抗体包被于载体表面
- 加酶标抗体与抗原结合
- 加酶作用的底物产生颜色
- 加待检物抗原与抗体结合
- 加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤
第36页：竞争法方法
- 竞争法方法
- 竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法
第37页：
第38页：洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYY
- 洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE
- 加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合
- 加酶作用的底物不显色或显色弱
- 加酶作用的底物显色
- 已知抗体包被于载体表面
- 已知抗体包被于载体表面
- 加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE
第39页：间接法方法用已知抗原包被，加入待测
- 间接法
- 方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
- 优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
- 应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法
第40页：
第41页：
第42页：双抗原夹心法原理
- 双抗原夹心法
- 原理：类似双抗体夹心法
- 操作步骤：类似
- 应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法
第43页：竞争法原理
- 竞争法
- 原理：类似检测抗原的竞争法
- 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测ELISA检测抗体的方法
第44页：捕获法应用
- 捕获法应用
- 捕获法应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法
第45页：捕获法原理
- 捕获法原理
- 捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色
第46页：洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYE
- 洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY
- 固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
- 固相化抗人IgM
- 加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合
- 加特异性抗原，与特异性抗体结合
- 加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色
- 加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合
- 加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合
- 加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色
第47页：第四节酶免疫测定的应用
第四节酶免疫测定的应用
第48页：均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物
均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。
第49页：1．酶免疫技术的要点？2．酶联免疫吸
思考题
- 酶免疫技术的要点？
- 酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？
- 竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？
- 常用的底物有哪几类？特点？
- 常用的酶有哪几类？特点？
- 何谓包被与封闭？其作用？
- 常用固相载体的种类和特点？
- 举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。
- ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？
- 对酶免疫技术的应用评价如何？
第50页：•酶免疫技术
- 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。
- 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。小结
