页数：47页文件大小：1.93 MB来源： 临床免疫学与免疫检验ppt课件
本课件介绍固相膜免疫测定的基本概述与膜载体特性，讲解免疫金标记技术的原理与制备方法，并说明免疫渗滤试验、免疫层析试验等膜载体免疫测定的种类、原理与结果判读要点。
随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。
第一节概述标记免疫测定放射免疫测定1960’酶免疫测定1970’荧光免疫测定1980’－1990’化学发光免疫测定1990’－膜固相免疫测定1990’－
一、免疫测定分类免疫浊度测定Ag + Ab AgAb + Ab标记免疫测定Ag + Ab* Ag Ab* + Ab*（B）（F）
二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体抗原抗体复合物Ag +Ab Ag * Ab
三、固相免疫测定B与F分离Ab* Ab*Ag + Ag + Ab*Ab Ab
五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜
固相NC膜
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第二节免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。
一、胶体金制备胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。
胶体金（Colloidal Gold）15~60 nm优质劣质
胶体金结合物（Conjugate）
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膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物
固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)
一、免疫渗滤测定(IFA)
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IFA——双抗体夹心法测抗原AB
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IFA——结果判断
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二、免疫层析测定（ICA ）
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ICA 试剂条样品垫结合物垫NC膜吸水垫
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ICA——双抗体夹心法测抗原
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ICA——间接法测抗体
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ICA 结果观察阳性阴性无效
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IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃ 6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3 min3~20 min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深
IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 横流（LATERAL FLOW）
GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图
GIFA技术的发展第一代1988HIVCHEK（DuPont）单点，5~10分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品改进抗原HIV 1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化。第八代INSTANTCHEK HIV 1+22点（测试+控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清、血浆、全血、尿液第九~十二代研制中单一试剂
ICA技术的发展1990年ABBOTT公司胶体硒标记ICAUnipath公司CLEARVIEW 立明衣原体彩色胶乳标记ICAROCHE Cardiac ReaderTnT 定量0.1~3 ng/ml合成TnT质控点
三、斑点酶免疫吸附试验——Dot-ELISA
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过CTL 公司生产的ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。
ELISAPOT
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ELISPOT结果判断
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方法学评价
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五、免疫印迹法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破坏而漏检
六、放射免疫沉淀试验原理放射免疫沉淀试验——抗原表位不会破坏
思考题
小结固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA 、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。
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