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22 免疫学检测技术.pptx

页数:68页文件大小:7.00 MB来源: 临床免疫学ppt课件

本课件讲解免疫学检测技术,先说明抗原抗体反应的特点与影响因素,随后依次展开直接凝集与间接凝集、液相与凝胶内沉淀反应、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、化学发光、胶体金与免疫印迹等标记技术,最后介绍免疫细胞分离、亚群分选及功能测定的常用方法。

免疫学检测技术封面,标示本章涵盖凝集、沉淀、免疫标记与免疫细胞功能检测
抗原抗体反应的四个特点:特异性、比例性、可逆性与阶段性
抗原抗体反应的影响因素:电解质、酸碱度pH6~8与温度条件,冷凝集素在4℃最适
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第1页:免疫学检测技术

免疫学检测技术:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第2页:抗原抗体反应的特点

  • 特异性 比例性 可逆性 阶段性

第3页:抗原抗体反应的影响因素

电解质 生理盐水或缓冲液,Ca2+,Mg2+ 酸碱度 pH6~8,补体pH7.3~7.4 温度 15℃~40℃,37℃最适 冷凝集素4℃最适

第4页:检测抗原和抗体的体外实验

检测抗原和抗体的体外实验:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第5页:凝集反应的概念

颗粒性抗原或吸附于载体颗粒上的可溶性抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合,在电解质参与下,出现肉眼可见的凝集现象。

第6页:直接凝集反应

颗粒性抗原直接与抗体结合,在电解质的参与下,出现肉眼可见的凝集现象。 常用颗粒性抗原:红细胞、细菌等 玻片法和试管法1

第7页:玻片凝集试验YYY+

玻片凝集试验YYY+:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第8页:结果判断阳性阴性

结果判断阳性阴性:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第9页:试管凝集试验

试管凝集试验:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第10页:间接凝集反应

将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面,与相应的抗体或抗原结合,在电解质的参与下,出现肉眼可见的凝集现象。2

第11页:用已知抗原致敏载体---检测未知抗体

  • 正向间接凝集试验

第12页:用已知抗体致敏载体---检测未知抗原

  • 反向间接凝集试验

第13页:二、沉淀反应 沉淀反应

  • 可溶性抗原与相应抗体结合,在一定条件下出现肉眼可见的沉淀现象

第14页:沉淀反应的类型 液相内沉淀反应 环状

沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀反应 单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术

第15页:(一)免疫浊度测定的原理 可溶性抗原

与相应抗体在特殊缓冲液中能快速形成一定大小的抗原抗体复合物,使反应液体变浑浊,呈现一定的浊度。 当抗体量恒定且过量时,浊度与抗原的量成正比。 利用光学测量仪器对浊度进行测定,从标准曲线查出抗原含量。

第16页:透射比浊法和散射比浊法光路检测器A检

  • 测器BICI0IθIθ透射比浊法散射比浊法

第17页:(二)凝胶内沉淀试验

可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的凝胶中向四周扩散,形成浓度梯度,两者相遇并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀物。

第18页:单向琼脂扩散试验

原理: 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中,使待测抗原在凝胶中自由扩散,与抗体结合形成沉淀环,沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。1

第19页:2.在标准曲线上查找相应抗原浓度

(沉淀环直径)2抗原浓度1.抗体混于凝胶中2.抗原加入孔内3.抗原自由扩散标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定1.测定沉淀环直径

第20页:双向琼脂扩散试验

原理: 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中,两者各自在凝胶中向四周自由扩散,当抗原与抗体相遇,在比例合适时形成沉淀线。2

第21页:3.呈现沉淀线或弧

  • 原理示意图AbAg模拟图染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果

第22页:抗体效价测定

  • 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价

第23页:“1”为单一抗原抗体系统

。“n”为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。抗原抗体纯度鉴定*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。

第24页:三、免疫标记技术-基本概念

免疫技术 以抗原-抗体反应原理为基础,对样品中相应抗原或抗体进行检测。——高特异性 标记技术 将可被探测的示踪物质(酶、荧光素、放射性核素、胶体金、化学发光物质等)用化学方法与化合物连接。——高敏感性

第25页:常用免疫标记技术 放射免疫技术 荧光

  • 免疫技术 酶免疫技术 胶体金免疫技术 化学发光免疫技术 生物素-亲和素免疫技术

第26页:(一)酶免疫技术

基本原理: 酶免疫技术是利用酶标记抗体(抗原)与相应抗原(抗体)反应形成抗原-抗体-酶复合物,酶催化相应的底物显色,根据颜色变化和显色深浅进行定性和定量。

第27页:辣根过氧化物酶(HRP) ELISA

  • 中应用最为广泛的标记酶 HRP常用底物 四甲基联苯胺TMB 无色——蓝色——黄色

第28页:微量反应板

微量反应板:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第29页:E固相抗体标本(含抗原)酶标抗体EE

  • 底物双抗体夹心法检测抗原

第30页:固相抗原标本(含抗体)酶标二抗底物E

  • EE间接法检测抗体

第31页:

第32页:

第33页:

第34页:(二)荧光免疫技术 荧光物质

  • 荧光物质是一类经激发能发射荧光的物质。 荧光色素:能产生明显荧光并可用作染料的有机化合物

第35页:200、PE等

  • 常用荧光色素1.荧光色素:FITC、RB

第36页:FITCRB200

FITCRB200:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第37页:荧光抗体技术的类型

荧光抗体技术的类型:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第38页:2、间接法FF荧光素标记抗体抗原抗体

2、间接法FF荧光素标记抗体抗原抗体:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第39页:

第40页:结果判定

阳性细胞显色有胞质型、胞核型、膜表面型,显色深浅可作为抗原定性、定位和定量依据。“-”为无或仅见极微弱荧光;“+”为荧光较弱但清楚可见;“2+”为荧光明亮;“3+”为耀眼的强荧光。“2+”以上判定为阳性,对照光应呈“-”或“±”。

第41页:①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核

  • 抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)荧光抗体技术的应用

第42页:(三)放射免疫技术

(三)放射免疫技术:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第43页:(四)电化学发光免疫技术

电化学发光免疫分析(ECLIA)是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原),以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。

第44页:

第45页:电化学发光免疫测定示意图

电化学发光免疫测定示意图:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第46页:46(五)胶体金免疫技术金免疫技术(

免疫金标记技术、免疫胶体金技术)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金原子颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。

第47页:胶体金结合物

胶体金结合物:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第48页:固相NC膜

固相NC膜:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第49页:胶体金免疫层析试剂条结构

胶体金免疫层析试剂条结构:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第50页:DICA——双抗体夹心法测抗原样品垫

  • 结合物垫NC膜吸水垫

第51页:免疫层析试验(双抗体夹心法)

第52页:

第53页:免疫印迹技术(Western blot)

  • 免疫印迹试验

第54页:

第55页:免疫细胞功能的检测

免疫细胞功能的检测:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第56页:一、免疫细胞的分离和纯化

PBMC包括:淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液:ficoll-hypaque,percoll

第57页:Ficoll分离法操作

聚蔗糖-泛影葡胺分层液(ficoll)法是一种单次密度梯度离心分离法,主要用于分离外周血中的单个核细胞。原理: Ficoll分层液:密度1.077±

第58页:Ficoll分离单个核细胞

Ficoll分离单个核细胞:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第59页:二、淋巴细胞亚群的分离

  • 方法类型: 1.E花环沉降法——T细胞-绵羊红细胞受体(CD2)

第60页:E花环沉降法

E花环沉降法:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第61页:2.荧光激活细胞分选仪分离法

2.荧光激活细胞分选仪分离法:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第62页:喷嘴Fluorescencesign

  • alsFocused laserbeam鞘液液流系统示意图

第63页:FlowTipLaserSS and

  • FLDetectorFS Detector光学系统示意图

第64页:光学系统

光学系统:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

第65页:细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂

  • 成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电分选基本原理

第66页:三、免疫细胞功能测定T淋巴细胞功能检

  • 测T淋巴细胞转化(增殖)试验

第67页:T淋巴细胞DNA合成分化淋巴母细胞刺

  • 激物——PHA、ConA细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松T淋巴细胞增殖试验

第68页:形态学检查法

形态学检查法:本页以图示为主,源文件未提取到更多文字说明,要点可对照原课件图片及相邻页的文字版。

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