04 第五章 细菌和噬菌体的遗传分析.ppt

第1页：第五章 细菌和噬菌体的遗传分析

第五章细菌和噬菌体的遗传分析

第2页：提纲I.细菌的遗传分析II.噬菌体的

提纲I.细菌的遗传分析II.噬菌体的遗传分析

第3页：细菌的遗传分析

第一节细菌的遗传分析1. 细菌概述2. 大肠杆菌的突变型和筛选3. 大肠杆菌的性别和杂交4. 致育因子(F因子)5. 低频重组与高频重组6. 中断杂交与作图7. 细菌的交换和重组8. 重组作图9. F’因子和性导

第4页：细菌概述

一. 细菌概述

• 细菌的细胞:细菌是原核生物(prokaryotes),无细胞核,不进行减数和有丝分裂,而是简单地复制和一分为二
• 细菌的染色体:细菌为单倍体,其染色体为环形双链DNA分子,不形成核小体结构。细胞壁(cell wall)细胞膜(plasma membrane)拟核(Nucleoid)性纤毛(pili)核糖体(Ribosome)(Flagella)

第5页：Electron micrograph ofthe

Electron micrograph ofthe bacteriumEscherichiacoli, whichhas had its DNAreleased by osmoticshock.

第6页：Typical bacterial population growth curve

Typical bacterial population growth curve showing the initial lag phase, the subsequentlog phase where exponential growth occurs, and the stationary phase that occurs whennutrients are exhausted.

第7页：大肠杆菌的突变型及筛选

二、大肠杆菌的突变型及筛选:1、大肠杆菌的突变型

• 合成代谢功能突变型(anabolic functional mutant): 缺陷型(deficient) 野生型(wild type)营养缺陷型(auxotroph) 原养型(prototroph)met-甲硫氨基酸突变型met+thi-硫胺突变型thi+pur-嘌呤突变型pur+
• 分解代谢功能突变型(catabolic functional mutant)lac-乳糖突变型,野生型为lac+
• 抗性突变型(resistance mutant):strr ,strs 分别表示对链霉素有抗性和敏感T1r, T1s分别表示对T1噬菌体有抗性和敏感

第8页：突变型的筛选

2、突变型的筛选

• 根据菌落特点筛选:如:伊红-美蓝培养基(EMB)
• 抗性突变型的筛选:将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上,能形成菌落的就是抗性突变菌株
• 营养缺陷型的筛选:印迹法(replica-plated method) : CM MMlac-突变菌株:白色或粉红色菌落lac+菌落:有金属光泽的紫色菌落。影印

第9页：细菌的杂交和性别

三、细菌的杂交和性别E.coli 接合的发现:1946年莱德伯格(Lederberg,J.)塔特姆(Tatum)细菌接合(conjugation)

第10页：细菌的杂交菌株

1、细菌的杂交菌株A: met-bio-thr+leu+thi+(需甲硫氨酸和生物素)菌株B: met+bio+thr-leu-thi-(需苏氨酸,亮氨酸和硫胺)A B完全液体培养基基本固体培养基结果:出现若干原养型菌落,频率为10-7 。

基本固体培养基

第11页：Genetic recombination of twoauxotrophic

Genetic recombination of twoauxotrophic strains producingprototrophs.

第12页：质疑:细菌的杂交实验获得重组子可能原

质疑:细菌的杂交实验获得重组子可能原因:⑴转化⑵互养

第13页：

第14页：When strain A and B auxotrophs are grown

When strain A and B auxotrophs are grown in a common medium but separated bya filter, no genetic recombination occurs and no prototrophs are produced. Theapparatus shown is a Davis U-tube.

第15页：结论与菌株

• 结论
• 菌株A与菌株B之间发生了杂交,发生了遗传物质的转移,出现了原养型
• 杂交过程中,两菌株的接触是必须的

第16页：细菌的性别菌株

2、细菌的性别菌株A: met-thr+leu+thi+(需甲硫氨酸)菌株B: met+thr-leu-thi-(需苏氨酸,亮氨酸和硫胺)A Str B出现原养型菌落A B Str不出现原养型菌落A:供体(donor) (雄性)B:受体(recipient)(雌性)MM+Str

第17页：F因子F因子:是一种质粒

四、F因子F因子:是一种质粒,又称为致育因子(fertility factor,F)。

F+菌:性伞毛(sex pili),即F纤毛。

F-菌:

第18页：Transmission electron micrograph of

Transmission electron micrograph of conjugating E.coli.

第19页：An electron micrograph of conjugation

An electron micrograph of conjugation between an F+E.colicell and an F-cell. The sex pilus linking them isclearly visible.

第20页：F因子与的结构配对区域

1、F因子(F-factor)的结构配对区域(pairing region)致育基因(fertility gene)原点(origin)原点(origin):(复制区)配对区域(pairingregion):(重组区)致育基因(fertilitygene):(接合转移区)F因子

第21页：

第22页：F-菌与

2、F-菌与F+菌的接合转移F+lac+F-lac-F-lac-F+lac+F+lac+F+lac+1)F+与F-接触形成结合管(conjugation tube).2)F因子滚环复制,转移到F-细胞。

3)F-细菌F+细菌。

第23页：

第24页：An F+×F-mating demonstratinghow the

An F+×F-mating demonstratinghow the recipient F-cell convertsto F+.

第25页：低频重组与高频重组

五、低频重组与高频重组1、低频重组(low frequency recombination,Lfr):F+与F-的杂交中,F因子的转移频率很高,但供受体细菌染色体的重组频率却很低,约为10-6,因此F+品系称为低频重组品系(菌株)。

第26页：高频重组

2、高频重组(High frequence recombination, Hfr)1951年Cavalli用氮芥处理F+,然后将处理后的F+×F-重组子,此称为Hfr。1954年Hayes 也分离了Hfr品系,发现:

• Hfr使重组能力增加,但无传递F因子的能力,Hfr ×F -F -
• Hfr只能将供体基因组的一部分传给受体,Hayes的解释是Hfr的F因子发生了永久性改变。10-4

第27页：解释:此品系中

解释:此品系中,F因子整合到了细菌染色体上,与F-细胞接合后将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体,当供体和受体的等位基因带有不同的遗传标记时,可观察到它们之间发生重组,频率可达到10-2以上,称为高频重组品系(菌株)。

但却很少使F-细菌转变成F+细菌。

第28页：F因子的整合和环出配对区域

F因子的整合和环出配对区域:插入序列(insertion sequence, IS) 配对和交换附加体(episome):

第29页：

第30页：×F-Hfr:杂交

六、中断杂交技术与作图1954年, Wollman和Jacob,实验:Hfr ×F-Hfr: thr+leu+azirtonrlac+gal+ strsF-: thr-leu-azistonslac-gal-strr混合间隔时间取样中断杂交稀释菌液选择培养基(thr+leu+str) 测定重组子链霉素抗性半乳糖能否利用乳糖能否利用Tl噬菌体抗性叠氮化钠抗性亮氨酸合成能力苏氨酸合成能力Hfr F-出现重组子菌落T1azilacThrleu

第31页：时间与分钟

时间(分钟)转移的基因〈9 -9azir11azirtonr18azirtonrlac+ 24azirtonrlac+ gal+ 1)T=0:杂交开始;2)T=8分钟内,无重组菌落出现;3)T=9分钟,有少量azir菌落,但仍为tons。

4)T=11分钟时,开始出现tonr菌落;5)T=18分钟时,出现lac+菌落;6)T=24分钟时,出现gal+菌落。

1、中断杂交实验结果

第32页：

第33页：The progressive transfer during

The progressive transfer during conjugation of variousgenes from a specific Hfr strainof E. colito an F-strain.

第34页：

第35页：Conversion of F+to an Hfrstate occurs by

Conversion of F+to an Hfrstate occurs by integrating theF factor into the bacterialchromosome.

第36页：不同的非选择标记进入受体且重组的

不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同,但都是稳定的

• 各基因的重组频率随着时间的增加而增加,直至极值
• 按时间顺序,先重组和后重组的基因,重组率的极值在逐步减少

第37页：中断杂交技术作图中断杂交技术

2、中断杂交技术作图中断杂交技术(interrupted mating technique):根据供体基因进入受体细胞的时间顺序可绘制连锁图。距离单位:分钟Hfr细菌的染色体从原点(Origin, O)开始,以线性方式进入F-细菌,基因进入F-有一定的时间顺序。每一次较远基因的转移,都意味着较近基因也要一同转移,因此,越早进入的基因,离原点越近,所能达到的重组频率也越高;越晚进入的基因,离原点越远,所能达到的重组频率也越低。O azi ton lac gal0 9 11 18 25

第38页：

第39页：A time map of the genes studied in the

A time map of the genes studied in the experiment

第40页：转移如果Hfr×F-杂交一直进杂交

3、F因子最后转移如果Hfr ×F-杂交一直进行到2小时再中断,某些F-受体转变为Hfr,即F因子也转移到受体,并使之成为Hfr 供体,但是频率很低,说明F 因子离原点最远。

O azi ton lac galF0 9 11 18 25120Hfr菌株染色体上F因子的转移造成了高频重组。

由于F因子离原点最远,转移频率很低,所以很少使F-变成Hfr或F+。

第41页：大肠杆菌染色体是环形的不同

4、大肠杆菌染色体是环形的不同Hfr菌株进行中断杂交实验,基因转移的顺序、起点和转移方向各不相同。

推断大肠杆菌的染色体为环形,而F因子在细菌染色体上有许多插入位点,且插入方向不同。

Hfr Ho thr azilac tsx gal trp mal xyl metB thiFC o tsx lac azi thr thi metB xyl mal trp gal FJ4 o thi metB xyl mal trp gal tsx lac azi thr FP72 o metB thi thr azi lac tsx gal trp mal xyl FTrp malGal xyltsx metBlac thiazi thrC P72H J4

第42页：a)The order of gene transfer in four Hfr

(a)The order of gene transfer in four Hfr strains, suggesting that the E. colichromosomeis circular. (b) The point where transfer originates (O) is identified in each strain.

第43页：细菌的交换和重组

七、细菌的交换和重组F-内基因子,(endogenote)供体外基因子,(exogenote)供体外基因子F-内基因子部分二倍体(partial diploid)

第44页：细菌的交换和重组的特点

细菌的交换和重组的特点1)F-受体很少得到完整的F因子,多数重组子仍为F-。

2)只有偶数次交换才能产生平衡的有活性的重组子;3)重组子只有一种类型,相反的重组子(reciprocal recombinant)不会出现。

第45页：重组作图当转移时间间隔在两分钟之内

八、重组作图当转移时间间隔在两分钟之内,如已知lac与ade紧密连锁,距离约为1分钟,中断杂交作图就不可靠,须用传统的重组作图(recombination mapping)紫红色菌落:lac+ade+780(亲本型)白色或粉红色菌落:lac-ade+220(重组型)Hfr: lac+ade+strsX F-: lac-ade-strr混合60minF-:ade+strr1000MM+str影印EMB

第46页：重组子的产生

1、重组子的产生lac-ade+strrlac+ ade+strrlac+ ade+ strslac-ade-strrlac-ade-strslac+ ade+ strslac-ade-strrlac+ ade-strs

第47页：重组频率的计算

2、重组频率的计算RFlac-ade = *100% lac-ade+lac+ade++lac-ade+1分钟相当于20%重组值,即:1min=20cM= *100%=22%=22cM 2201000

第48页：大肠杆菌的遗传图谱图距单位

3、大肠杆菌的遗传图谱图距单位:分钟总长度:100分钟起点(0分钟):thr座位大肠杆菌的环形遗传学图

第49页：TheE.coligenome

TheE.coligenome.

第50页：F’因子和性导

九、F’因子和性导Adel berg,1959年F’因子(F-primer factor) 性导(sex-duction or F’-duction)

第51页：

第52页：Conversion of an Hfr bacterium to F’and

Conversion of an Hfr bacterium to F’and its subsequent mating with an F-cell.

第53页：F-,与细菌的相互转化

1、F-,F+,Hfr,F’细菌的相互转化F+ F-HfrF+ F-F+F-结合吖黄素高频重组低频重组整合F’F’重组频率较低

第54页：种致育因子的相互关系

2、三种致育因子的相互关系

• 有F因子的细菌为F+,无F因子为F-,具有致育因子(F, F’或Hfr)的菌株就是雄性菌株(male strains)
• F因子可以整合到细菌染色体上,形成Hfr菌株。不同Hfr菌株F因子的整合位点不同
• F因子又可以从Hfr染色体上剪切下来,产生F因子。如果剪切不准确而带有一段细菌染色体,则称为F’因子
• F因子很容易转移到F-细胞中,F+×F-F+,但是供体染色体的转移频率很低, 重组频率很低
• Hfr能以高频率把细菌染色体基因转移到F-细菌中,却极少使F-变为F+(因为F因子位于Hfr染色体的最末端)
• F’因子的性质介于F+和Hfr之间,即可转移自身,又可以转移细菌基因。但频率较低

第55页：噬菌体的遗传分析

第二节噬菌体的遗传分析1. 病毒概述2. 噬菌体的繁殖和感染周期(infection cycle)

• 烈性噬菌体
• 温和性噬菌体3. 噬菌体的突变型4. 噬菌体的基因重组5. 转导与作图
• 普遍性转导
• 局限性转导

第56页：噬菌体的结构和形态病毒无细胞结构

一、噬菌体的结构和形态病毒无细胞结构,仅由蛋白质和核酸构成,可以分为:

• 动物病毒
• 植物病毒
• 细菌病毒(噬菌体, bacteriophage, phage)T噬菌体的结构蛋白质外壳核酸

第57页：

第58页：噬菌体的繁殖和感染周期

二、噬菌体的繁殖和感染周期(1). 烈性噬菌体: 如T噬菌体吸附细菌裂解,释放出子代噬菌体颗粒细菌染色体降解噬菌体DNA和蛋白质外壳包装成子代噬菌体颗粒

第59页：

第60页：

第61页：

第62页：The structure of bacteriophage T4

The structure of bacteriophage T4 including an icosahedralhead filled with DNA, a tail consisting of a collar, tube sheath,base plate, and tail fibers.

第63页：Life cycle of bacteriophage T4

Life cycle of bacteriophage T4.

第64页：

第65页：The plaque assayfor bacteriophageanalysis

The plaque assayfor bacteriophageanalysis.

第66页：温和噬菌体

(2). 温和噬菌体:吸附溶菌周期-uv诱导细菌裂解溶源周期如噬菌体:原噬菌体

第67页：Electron micrographs of phage lambda

Electron micrographs of phage lambda (left) andthe DNA isolated from it (right).

第68页：

第69页：噬菌体的突变型

三、噬菌体的突变型1). 条件致死突变型:

• 温度敏感突变
• 抑制因子敏感突变2).宿主范围突变型:E.coli B E.coli B/2 E.coli B+E.coli B/2 h++-半透明噬菌斑h-++ 透明噬菌斑3).噬菌斑形态突变型:
• r+ 小噬菌斑,边缘模糊
• r-大噬菌斑,边缘清晰: 快速溶菌(rapid lysis)

第70页：噬菌体的基因重组

四、噬菌体的基因重组1、基因重组用T2噬菌体h-r+和h+r-混合感染E.coli B,再用释放出来的子代噬菌体感染E.coli B+E.coli B/2 ,出现四种噬菌斑: 透明小噬菌斑(h-r+) 半透明大噬菌斑(h+r-) 透明大噬菌斑(h-r-) 半透明小噬菌斑(h+r+)T2噬菌体的四种噬菌斑重组率=(h+r++h-r-) 总噬菌斑数

第71页：

第72页：T2的环形遗传图

2、T2的环形遗传图

第73页：

第74页：转导与作图转导

五、转导与作图转导(transduction):以噬菌体为媒介,将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌.供体A 受体B

• 普遍性转导
• 局限性转导噬菌体

第75页：转导的发现

1、转导的发现1952年J.Lederberg,N.Zinder发现。

• P22的侵染性和FA的能力都可被一些水解酶,如DNase和胰蛋白酶所抑制
• FA的大小和质量与P22相同
• 用P22抗血清或加热处理都可以使P22和FA失活,且失活速率相同
• FA和P22的宿主范围相同。(一) 普遍性转导

第76页：The Lederberg-Zinder experiment using

The Lederberg-Zinder experiment using Salmonella.

第77页：

第78页：Generalized transduction

Generalized transduction.

第79页：

第80页：普遍性转导

普遍性转导(generalized transduction):噬菌体携带供体染色体片段是完全随机的, 供体染色体中所有基因具有同等机会被转导入受体,而且各个标记基因被转移的频率大致相等.这是因为噬菌体将供体染色体降解,在合成自身DNA和包装时,偶尔会将细菌染色体片段包装进入子代噬菌体颗粒,并带入受体菌。

如用P22噬菌体转导沙门氏菌:供体A: trp+phe+tyr+受体B: trp-phe-tyr-可出现大致相等的重组子:trp+phe-tyr-trp-phe+tyr-trp-phe-tyr+普遍性转导的频率较低,约为10-5,两个基因同时转导的频率则更低, 仅有10-510-5=10-10.

第81页：

第82页：如果两个基因同时转导的频率则较高

如果两个基因同时转导的频率则较高,则说明它们相互连锁,成为共转导(cotransduction)。

共转导的频率越高,则基因连锁越紧密.反之则基因距离越远.据此可用于细菌染色体的基因作图.

第83页：局限性转导

(二)局限性转导(restricted transduction)J. Lederberg& N. Zinder发现,又叫特异性转导(specialized transduction)。

野生型E.coliUV 细胞裂解K12 (λ)gal+诱导感染非溶原的品系基本10-6gal+培养基选择转导体

第84页：这类噬菌体只能转移细菌染色体的特定部

这类噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因.如噬菌体是一种附加体(episome), 既可作为一个复制因子独立存在,又可以整合到细菌染色体上的特定位点——attB位点,而形成原噬菌体。

attB位点一边是gal基因,另一边是bio。

在紫外线诱导下,原噬菌体从细菌染色体上离开时,偶尔带有宿主细菌基因,包装形成局限性转导的噬菌体颗粒,可将供体基因转移至受体细菌,但仅限于靠近attB位点附近的基因,如噬菌体专门转导gal和bio基因。

第85页：Electron micrographs of phage

Electron micrographs of phage lambda(left) and the DNA isolated from it(right).

第86页：

第87页：

第88页：局限性转导的特点

1、局限性转导的特点1)受包装容量限制,局限性转导形成的噬菌体往往是缺失体(defective),用dgal或dbio表示。由于缺失一段自身DNA,不能产生成熟的颗粒,因此局限性转导的频率很低,只有10-6,所以又称为低频转导(low frequency transduction,LFT)。2)供体基因不是置换受体基因,而是插入attB位点,因此使宿主体内带有两个拷贝的转导基因。例如用dgal+转导受体gal-后,宿主体内将既有gal+又有gal-,由于gal+对gal-为显性,因此宿主能够利用半乳糖。

第89页：进一步发现

进一步发现:

• 这些转导子是溶原的,具有“免疫力”。说明什麽?
• gal+转导子遗传特点不稳定,有1-10%又变成gal-。表明什麽?
• gal+转导子在细菌裂解时不能产生成熟的噬菌体。作何推论?

第90页：附着位点

附着位点(attachment site ,att)attB(又叫attλ),attP 正常的切离 非正常切离 λdg(λd gal) λdgal λdbio 低频转导(low-frequency transduction, LFT) 高频转导(High-feequency transduction, HFT)

第91页：总结: 在细菌中遗传物质有三种转移的

总结: 在细菌中遗传物质有三种转移的形式:转化(transformation)接合(conjugation)转导(transduction) 共同特点是:

• 单方向转移
• 产生部分二倍体(partialdiploid)
• 基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传

第92页：自然转化

自然转化(natural transformation)在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA,通过它来进行遗传转化;枯草杆菌中的转化属于自然转化。

工程转化(engineered transformation)在这种转化中,细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。

E.coli 转化就属于工程转化。

第93页：接合是DNA从细胞到细胞直接转移

接合是DNA从细胞到细胞直接转移。转化细胞从周围介质中吸收裸露的DNA。转染对裸露的病毒基因组DNA/RNA的吸收。(在动物细胞中,从周围介质中吸收任何裸露DNA都称为转染。在酵母和植物细胞中导入裸露的DNA可以称为转染或转化)

第94页：转导通过病毒颗粒介导将染色体或质粒

转导通过病毒颗粒介导将染色体或质粒DNA转移到细胞中。普遍性转导:宿主DNA片断可能取代病毒基因组被包装在噬菌粒中

• 载体为P1,P22噬菌体
• 经错误包装宿主DNA片断和同源重组
• 转移任何片断。特异性转导:宿主DNA共价地加入到病毒基因组中
• 载体为λ噬菌体
• 经特异位点整合或同源重组
• 转移特定的基因

第95页：

第96页：Proposed steps fortransforming a

Proposed steps fortransforming a bacterial cellby exogenous DNA.