08 第八章 微生物的遗传.ppt

第1页：遗传变异与育种章节封面

第八章

第2页：工业发酵菌种的要求

• 理想的工业发酵菌种应符合以下要求①遗传性状稳定
• ②生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染
• ③目标产物的产量尽可能接近理论转化率
• ④目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离
• ⑤尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离
• ⑥培养基成分简单、来源广、价格低廉
• ⑦对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感
• ⑧对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗

第3页：微生物的独特生物学特性

• 微生物的独特生物学特性（1） 个体的体制极其简单
• （2） 营养体一般都是单倍体
• （3） 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖
• （4） 繁殖速度快
• （5） 易于积累不同的中间代谢产物或终产物
• （6） 菌落形态特征的可见性和多样性
• （7） 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性
• （8） 易于形成营养缺陷型

第4页：研究微生物遗传学的意义

• 微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。
• 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。
• 研究微生物遗传学的意义

第5页：代谢发育

遗传与变异的

遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。

第6页：遗传与变异的概念

• 变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。
• 变异的特点：a. 在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）
• b. 形状变化的幅度大
• c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。
• 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。
• 特点是：a. 几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化
• b. 性状变化的幅度小
• c. 因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。

第7页：种质连续理论

• 第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883~1889 年间 Weissmann 提出。
• 认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。
• 基因学说：1933 年摩尔根（Thomas Hunt Morgan） 发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。
• 但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。
• 20 多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4 种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。
• DNA 是遗传变异的物质基础的证明：1944 年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质

第8页：经典转化实验

• 1928 年，Griffith 进行了以下几组实验：（1） 动物实验对小鼠注射活 RII 菌或死 SIII 菌————小鼠存活对小鼠注射活 SIII 菌————————小鼠死亡对小鼠注射活 RII 菌和热死 SIII 菌———小鼠死亡抽取心血分离活的 SIII 菌
• 一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）SIII 型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 RII 型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性
• （一） 经典转化实验（transformation）

第9页：转化实验的动物与培养结果

混合培养 RII 型活菌 SIII 型活菌 SIII 型热死菌 RII 型活菌 SIII 型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死 Griffith 转化试验示意

第10页：细菌培养

• （2） 细菌培养实验（3）S 型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的 SIII 型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入 RII 型细胞并使 RII 型细胞获得稳定的遗传性状，转变为 SIII 型细胞。
• 热死 SIII 菌—————不生长活 RII 菌—————长出 RII 菌热死 SIII 菌—————长出大量 RII 菌和10-6SIII 菌活 R 菌+S 菌无细胞抽提液——长出大量 R 菌和少量 S 菌+活 RII 菌平皿培养

第11页：DNA作为转化因子的验证

• ①加 S 菌 DNA②加 S 菌 DNA 及 DNA 酶以外的酶③加 S 菌的 DNA 和 DNA 酶④加 S 菌的 RNA⑤加 S 菌的蛋白质⑥加 S 菌的荚膜多糖活 R 菌长出 S 菌只有 R 菌1944 年 O.T.Avery、C.M.MacLeod 和 M。
• McCarty 从热死 S 型 S.pneumoniae 中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有 S 型细菌的 DNA 才能将 S.pneumoniae 的 R 型转化为 S 型。
• 且 DNA 纯度越高，转化效率也越高。
• 说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的，是遗传因子

第12页：噬菌体感染实验A.D.H

（二） 噬菌体感染实验 A. D. Hershey 和 M. Chase，1952 年（1） 含32P-DNA 的一组：放射性85%在沉淀中10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性

第13页：噬菌体感染实验

沉淀中含25%放射性以32S 标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2） 含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中10 分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含75%放射性

第14页：植物病毒的重建实验

• （三） 植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel Con rat（1956） 用含 RNA 的烟草花叶病毒（TMV） 进行了著名的植物病毒重建实验。
• 将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与 RNA 核心相分离。
• 分离后的 RNA 在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

第15页：TMV与HRV的重建

• MTVHRVHRVMTV（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主：（1） 表现 TMV 的典型症状病分离到正常 TMV 粒子（2） 表现 HRV 的典型症状病分离到正常 HRV 粒子。
• 上述结果说明，在 RNA 病毒中，遗传的物质基础也是核酸。
• 选用 TMV 和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的 RNA 和蛋白质，将两种 RNA 分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒

第16页：遗传物质在细胞内的存在部位

• （一） 核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外 DNA 染色体水平:倍性(真核) 和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA 或 RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录——翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基
• 二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式

第17页：原核生物的质粒的定义

• 三、原核生物的质粒定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋 DNA 分子，能独立于细胞核进行自主复制。
• 大小：约为2-100×106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。
• 性质：①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome） 的形式存在
• ②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体 DNA 复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5） 个拷贝
• 松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体 DNA 复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200 个或更多

第18页：原核生物的质粒

• ③可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞
• 质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段） 一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。
• ④对于细菌的生存并不是必要的⑤功能多样化功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。
• 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。
• 存在范围：很多细菌如 E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除 RNA 和蛋白质等步骤。
• 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法
• 三、原核生物的质粒

第19页：几种代表性质粒

几种代表性质粒

几种代表性质粒Figure.

Representative FERTILITY PLASMID.A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.

In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes. 1.

F–因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别

第20页：R因子

• 最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于 Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas 和 Staphylococcus 中。
• –R 因子由相连的两个 DNA 片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF ） 和抗性决定 R 因子（r-determinant），RTF 为分子量约为11×106Dalton，控制质粒 copy 数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100×106Dalton 以上。
• 其上带有其它抗生素的抗性基因。
• –R-因子在细胞内的 copy 数可从1~2 个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000 个/细胞。
• 2. R 因子（resistance factor）

第21页：Col因子

• 产大肠杆菌素因子。
• 大肠杆菌素是由 E.coli 的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。
• 其分子量约4×104-8×104Dalton。
• 大肠杆菌素都是由 Col 因子编码的。
• Col 因子可分为两类，分别以 ColE1 和 ColIb 为代表。
• ColE1 分子量约为5×106Dalton，无接合作用，是多 copy 的
• ColE1 研究得很多，并被广泛地用于重组 DNA 的研究和用于体外复制系统上。
• ColIb 分子量约为80×106Dalton，它与 F 因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有1-2 个 copy。

第22页：Ti质粒

• 4. Ti 质粒（tumor inducing plasmid） 即诱癌质粒。
• 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 中,可引起许多双子叶植物的根癌。
• 当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的 DNA 释放到植物细胞中。
• 这时，含有复制基因的 Ti 质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。
• Ti 质粒长200kb，是一个大型质粒。
• 当前，Ti 质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。
• 一些具有重要性状的外源基因可借 DNA 重组技术设法插入到 Ti 质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的

第23页：巨大质粒

• 是近年来在 Rhizobium（根瘤菌属） 中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。
• 6. 巨大质粒（mega 质粒）
• 5. 降解性质粒降解性质粒只在假单胞菌属中发现。
• 它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。
• 这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解 CAM（樟脑） 质粒，XYL（二甲苯） 质粒，SAL（水杨酸） 质粒，MDL（扁桃酸） 质粒，，NAP（奈） 质粒和 TOL（甲苯） 质粒等

第24页：原核生物的基因系统

基因原核生物基因系统：启动子（基因） 操纵子操纵子（基因） 基因调控系统结构基因调节基因基因是能够表达和产生基因产物（蛋白质或 RNA） 的 DNA 序列

第25页：核酸存在的七个水平

• 细胞水平：大部分或全部 DNA 都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同
• 染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体
• 而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。
• 一些真核生物和原核生物基因组的比较生物单倍体的分子量核苷酸已知染色体数约数（Da） 对数基因数人323~5 ×10125~7 ×109~4000 黑腹果蝇
• 47.9 ×10108.0 ×1075000~6000 粗糙脉孢菌
• 72.8 ×10104.5 ×107>500 大肠杆菌
• 12.5 ×1093.8 ×106~1027 噬菌体 T4 11.1 ×1082.0 ×105 ~135 噬菌体
• 13.2 ×1074.8 ×104~35 噬菌体 MS2 11.1 ×1063.5 ×1033

第26页：密码子与不对称转录

• 密码子（coden）：由3 个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位不对称转录：只有 DNA 双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。
• 起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：UAA、UGA、UAG 遗传密码指 DNA 链上各个核苷酸的特定排列顺序

第27页：核外DNA的种类

核外 DNA 的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒线粒体细胞质基因叶绿体（质体） 中心体动体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m 质粒 F 因子 R 因子 Col 质粒 Ti 质粒巨大质粒降解性质粒

第28页：突变与染色体畸变

• 第二节基因突变和诱变育种突变（mutation） 指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。
• 染色体畸变——细胞学上可以看到染色体的变化基因突变——细胞学上看不到遗传物质的变化突变体（mutant） 发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（wild type） 从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株

第29页：★依表型的改变分为：形态

• ★依表型的改变分为：形态突变型——营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。
• 发酵突变型——丧失产生某种生物合成酶能力的突变型抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变产量突变型——（一） 基因突变的类型

第30页：★按是否比较

• ★按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH 值等，就比较容易检出和分离到。
• 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异

第31页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第32页：突变率的定义

• （二） 突变率定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。
• 突变率为10–8 是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。
• 突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型） 的数目来表示。
• 如一个含108 个细胞的群体，当其分裂为2×108 个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10–8 。
• 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。
• 某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。
• 在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。
• 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutant 或 reverse mutant） 或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定

第33页：细菌的自发突变率

细菌的自发突变率

若干细菌某一性状的自发突变率菌名突变性状变率E. coli抗T1噬菌体3 ×10–8E. coli抗T3噬菌体1 ×10–7E. coli不发酵乳糖1 ×10–10E. coli抗紫外线1 ×10–5Staphylococcus aureus抗青霉素1 ×10–7S. aureus抗链霉素1 ×10–9Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 ×10–6Bacillus megaterium抗异烟肼5×10–5

第34页：突变的特点

• （三） 突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。
• 不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。
• 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。
• 稀有性：突变率低且稳定。
• 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。
• 可诱发性：诱变剂可提高突变率。
• 稳定性：变异性状稳定可遗传。
• 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation 或 reverse mutation）

第35页：基因突变的自发性和不对应性

• （四） 基因突变的自发性和不对应性的证明在各种基因突变中，抗性突变最为常见。
• 但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。
• 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象） 诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。
• 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。
• 由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。
• 从1943 年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争

第36页：变量试验

• 变量试验又称波动试验或彷徨试验。
• 1943 年，S. E. Luria 和 M. Delbrück 根据统计学原理，设计了左方的实验。
• 1. 变量试验 fluctuation test

第37页：涂布试验原理

2. 涂布试验原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率

第38页：涂布试验

• 涂布试验中突变率的计算初始接种量：5 ×104 个/皿培养5 小时，繁殖了
• 12.3 代，每个微菌落约含5100 个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100 ×5 ×104≈ 2.6 ×108 个/皿在6 个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 ×（2.6 ×1085 ×104）= 15.6 ×108 在未涂布的平板上共发现28 个突变，故突变率= 28/15.6 ×108= 1.8 ×108

第39页：平板影印培养

• 3. 平板影印培养试验（replica plating）1952 年，J. Lederberg 夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。
• 平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。
• 然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。
• 待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。
• 据报道，用此法可把母平板上10~20%量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8 个子培养皿。
• 因此，通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变

第40页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第41页：平板影印培养

• 平板影印培养法在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。
• 平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会

第42页：基因突变的机制

• （五） 基因突变的机制基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为点突变和畸变。
• 具体类型可归纳如下

第43页：诱变剂与诱变机制

• 1. 诱变机制诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂. 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。
• 即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。
• 按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制

第44页：碱基置换的定义

• （1） 碱基置换（substitution） 定义：对 DNA 来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。
• 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。
• 分类：转换（transition），即 DNA 链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换
• 颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。
• 对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。
• 根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论

第45页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第46页：引起置换的诱变剂的定义

直接引起置换的诱变剂

一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。

种类

很多。

第47页：诱变剂的作用机制

若干诱变剂的作用机制及诱变功能诱变因素在 DNA 上的初级效应遗传效应碱基类似物掺入作用 AT=GC 双向转换羟胺与胞嘧啶起反应 GC→AT 的转换亚硝酸 A、G、C 的氧化脱氨作用交联 AT=GC 双向转换缺失烷化剂烷化碱基（主要是 G） 烷化磷酸基团丧失烷化的嘌呤糖-磷酸骨架的断裂 AT=GC 双向转换 AT→TA 的颠换 GC→CG 的颠换巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丫啶类碱基之间相互作用双链变形码组移动（＋或－） 紫外线嘧啶的水合物形成嘧啶的二聚体交联 GC→AT 转换码组移动（＋或－） 电离辐射碱基的羟基化核降解 DNA 降解糖-磷酸骨架的断裂丧失嘌呤 AT=GC 双向转换码组移动（＋或－） 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 加热 C 脱氨基 CG→TA 转换 Mu 噬菌体结合到一个基因中间码组移动

第48页：碱基转换的分子机制

• 亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用 HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）HNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H）HNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在 DNA 复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。
• 碱基转换的分子机制——以亚硝酸为例

第49页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第50页：碱基转换过程

腺嘌呤（A） 变成次黄嘌呤（H） 后引起的转换过程①腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He）②He 通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）③DNA 复制时，HK 与胞嘧啶（C） 配对④DNA 第二次复制时，C 与 G 正常配对，实现转换

第51页：亚硝酸引起的AT-GC转换细节

亚硝酸引起的 AT-GC 转换细节

第52页：间接引起置换的诱变剂

• 这类诱变剂主要是一些碱基类似物,如：5-溴尿嘧啶(5-BU) 和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT） 等等
• 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到 DNA 分子中，主要是在 DNA 复制时碱基类似物插入 DNA 中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。
• 以5-溴尿嘧啶(5-BU) 为例：5-BU 是胸腺嘧啶（T） 的类似物，酮式的5-BU 可以和 A 配对，烯醇式的5-BU 可以和 G 配对，在 DNA 分子复制的过程中，由于5-BU 的插入和互变异构导致碱基置换。
• 间接引起置换的诱变剂

第53页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第54页：-BU引起的转换

5-BU 引起的转换

第55页：-BU引起的转换从上图

• 5-BU 引起的转换从上图中，还可以看到5-BU 的掺入引起的 G┇C 回复到 A׃T 的过程。
• 通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。
• 也可以知道，为什么像5-BU 这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的 DNA 分子却不起作用

第56页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第57页：移码突变

• （2） 移码突变 frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指诱变剂使 DNA 分子中增加（插入） 或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
• 由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。
• 与染色体畸变相比，移码突变也只能算是 DNA 分子的微小损伤。
• 丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列称为 ICR 类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂

第58页：诱发移码突变的化合物

• 图8-14——能诱发移码突变的几种代表性化合物引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。
• 这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤—嘧啶对十分相似

第59页：丫啶类化合物的诱变机制

• 丫啶类化合物的诱变机制至今还不很清楚。
• 有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤–嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻 DNA 碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距
• 0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成
• 0.68nm），从而在 DNA 复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变

第60页：移码突变及其回复突变

丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示

第61页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第62页：染色体畸变

（3） 染色体畸变（chromosomal aberration） 某些理化因子，如 X 射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起 DNA 的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，它包括：染色体结构上的变化：缺失（deletion） 重复（duplication） 易位（translocation） 倒位（inversion） 染色体数目的变化

第63页：染色体畸变的类型

• 染色体结构上的变化分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。
• 染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加
• 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。
• 倒位--------是指断裂下来的一段染色体旋转180 后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反
• 易位--------是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。
• 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位

第64页：染色体畸变

染色体畸变

第65页：转座因子

• 转座因子（transposible element） 由40 年代 B. McClintock 对的遗传研究而发现染色体易位，自1967 年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实，并已成为分子遗传学研究中的一个热点。
• 旧概念：基因是固定在染色体 DNA 上的一些不可移动的核苷酸片段。
• 新发现：有些 DNA 片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。
• 在这些 DNA 顺序的跳跃过程中，往往导致 DNA 链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。
• 转座因子（transposible element）：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段 DNA 顺序。
• 也称作跳跃基因（jumping gene） 或可移动基因（movable gene）

第66页：~1.4kb），只能引起转

• 转座因子的种类（1） 插入序列（IS，insertion sequence）：特点是分子量最小（仅
• 0.7~1.4kb），只能引起转座（transposition） 效应而不含其它基因。
• 可以在染色体、F 因子等质粒上发现它们。
• 已知的 IS 有5 种，即 IS1、IS2、IS3、IS4 和 IS5。
• E.coli 的 F 因子和核染色体组上有一些相同的 IS（如 IS2，IS3 等），通过这些同源序列间的重组，就可使 F 因子插入到 E.coli 的核染色体组上，从而使后者成为 Hfr 菌株。
• 因 IS 在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。
• IS 引起的突变可以回复，其原因可能是 IS 被切离，如果因切离部位有误而带走 IS 以外的一部分 DNA 序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变

第67页：转座因子的种类

• 转座因子的种类（2） 转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）：IS 和 Mu 噬菌体相比，Tn 的分子量是居中的（一般为2~25kb）。
• 它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。
• Tn 虽能插到受体 DNA 分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入

第68页：转座因子的种类

• 转座因子的种类（3）Mu 噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体）：它是 E . coli 的一种温和噬菌体。
• 与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu 噬菌体并没有一定的整合位置。
• 与以上的 IS 和 Tn 两种转座因子相比，Mu 噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20 多个基因。
• Mu 噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变

第69页：自发突变机制

• 2. 自发突变机制自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。
• 几种自发突变的可能机制微生物自身有害代谢产物的诱变效应过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。
• 它对 Neurospora（脉孢菌） 有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂 KCN，则又可提高突变率。
• 这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变”中一种内源性诱变剂。
• 在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因

第70页：互变异构效应

• 互变异构效应碱基 T、G 的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现 C、A 的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现平衡一般趋向于酮式或氨基式，在 DNA 双链结构中一般总是以 A︰T 和 G┇C 碱基配对的形式出现在偶然情况下，在 DNA 复制到达这一位置的瞬间，在 T 以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现 G 同样，如果 C 以稀有的亚氨基形式出现在 DNA 复制到达这一位置的瞬间，则在新合成 DNA 单链中与 C 相对应的位置上就将是 A。
• 这可能就是发生相应的自发突变的原因。
• 要预言在某一时间、某一基因发生自发突变是不可能的。
• 在运用数学方法对这些偶然事件做大量统计分析后，可以发现并掌握其中的规律。
• 例如，据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10 –8 ~ 10 –9

第71页：而在下链中，复制仍正常进行

• 环出效应即环状突出效应。
• 有人提出，在 DNA 的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。
• 下图就是环出效应的设想机制。
• 在上链中，标记 B 处发生“环出”，故只有 A 及 C 能获得复制，从而发生自发突变。
• 而在下链中，复制仍正常进行

第72页：紫外线对DNA的损伤与修复

• （六） 紫外线对 DNA 的损伤及其修复已知的 DNA 损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。
• 发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray） 的作用。
• 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。
• 嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。
• 其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。
• 紫外线的主要作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。
• 二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
• 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。

第73页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第74页：光复活作用

• 光复活作用（photo reactivation） 定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。
• 这一现象最早是 A.Kelner（1949） 在 Strepotomyces griseus（灰色链霉菌） 中发现的。
• 后来，在许多微生物中都得到了证实。
• 最明显的是在 E.coli 的实验中：对照：8×106 个/ml E.coli U.V.100 个/ml E.coli 试验：8×106 个/ml E.coli U.V. 360~490nm 2×106 个/ml E.coli 可见光，30 分经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的 DNA 分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photo reactivating enzyme） 即光裂合酶（photolyase） 结合，当形成的复合物暴露在可见光（300~500nm） 下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。
• 与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。
• 每一 E.coli 细胞中约含有25 个光激活酶分子。
• 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液

第75页：图:光复活作用

图:光复活作用

第76页：暗修复作用

• 暗修复作用（dark repair） 又称切除修复（excision repair）。
• 是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X 射线和γ射线等） 损伤后的 DNA 的机制。
• 这种修复作用与光无关。
• 有四种酶参与——①内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH 和5’-P 的单链缺口
• ②外切核酸酶从5’-P 至3’-OH 方向切除二聚体，并扩大缺口
• ③DNA 聚合酶以 DNA 的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH 端起逐个延长，重新合成一段缺失的 DNA 链
• ④通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH 末端与原链的5’-P 末端相连接，从而完成了修复作用

第77页：暗修复作用

• 暗修复作用（dark repair）
• 1、由核酸内切酶切开二聚体的5’末端，形成3’-OH 和5’-P 的单链缺口
• 2、核酸外切酶从5’-P 到3’-OH 方向切除二聚体，并扩大缺口。
• 3、DNA 聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH 端起合成缺失片段。
• 4、连接酶将新合成的3’-OH 与原有的5’-P 相连接

第78页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第79页：紫外诱变方法

• 紫外诱变方法设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，紫外灯：波长为
• 253、7nm, 功率是15W 处理时的照射距离：20cm —30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。
• 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量

第80页：紫外照射剂量的影响

• 由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。
• 一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。
• 通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。
• 生产上经常采用的剂量：死亡率为70%——80%左右

第81页：重组修复

• 重组修复必须在 DNA 复制的情况下进行，所以又叫复制后修复。
• 细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙。
• 通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，DNA 聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复，重组修复中的 DNA 损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例逐渐降低

第82页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

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第83页：诱变育种

• 诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA） 的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
• 诱变育种具有极其重要的实践意义。
• 当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。
• （七） 诱变育种

第84页：诱变育种的步骤

诱变育种的步骤原始菌种纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分离移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率观察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定

第85页：诱变育种的基本过程

诱变育种的基本过程选择选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验

第86页：出发菌株的选择

• 1. 出发菌株的选择出发菌株———用来育种处理的起始菌株◆出发菌株应具备：①对诱变剂的敏感性高
• ②具有特定生产性状的能力或潜力
• 出发菌株的来源
• ①自然界直接分离到的野生型菌株：②历经生产考验的菌株：③已经历多次育种处理的菌株

第87页：细胞悬液的制备

• 2. 制备细胞悬液要求：①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长
• ②细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）
• 方法：①玻璃珠打散10-15min
• ②加
• ０.3%吐温80（表面活性剂）③用无菌脱脂棉过滤。
• 制备：物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂——缓冲液浓度：细菌、放线菌108 个/ml 霉菌、酵母菌106 个/ml

第88页：诱变处理诱变剂的作用

• 表型迟延现象:指某一突变在 DNA 复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。
• 产生原因：①分离性迟延现象
• ②生理性迟延现象
• 3. 诱变处理诱变剂的作用：①提高突变的频率②扩大产量变异的幅度③使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。
• —致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。
• 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70～80%）

第89页：选择诱变剂的种类

• 选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素
• 而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。
• 在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如 NTG。
• 简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
• 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。
• 一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种

第90页：诱变处理方式

诱变处理方式：单一因子处理：复合因子处理：先后使用同时使用单一因子重复使用两种以上因素

第91页：菌种筛选

• 4. 菌种筛选
• 4.1 筛选方案：实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。
• 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网
• ——因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次
• 初筛手段应尽可能快速、简单。
• 复筛的目的：确认符合要求的菌株
• ——复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。
• 筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤. 常用诱变剂的使用方法

第92页：诱变育种的筛选环节

可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下

第93页：诱变育种的基本环节

第一轮：一个出发菌株→→→选出200 个菌株→→→选出50 株→→→选出5 株诱变处理初筛（每瓶一株） 复筛（每瓶四株） 第二轮：5 个出发菌株→→→ →→ → 选出50 株→→ →选出5 株40 株40 株40 株40 株40 株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）

第94页：摇瓶培养法与筛选方法

• 4.2 变异菌的一般筛选方法
• 4.2.1 平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法
• 4.2.2 摇瓶培养法

第95页：3 特殊变异菌的筛选方法等要点导览

• 以温度敏感突变为例：筛选方法：用途：常用于提高代谢物产量原因：是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失重要性：如果此酶为蛋白质、核酸合成途径中所需的酶，则此变异株在高温下的表型就是营养缺陷型。
• 4.3.1 条件抗性突变型的筛选
• 4.3 特殊变异菌的筛选方法

第96页：谷氨酸发酵的温度控制

• 在富含生物素的培养基中进行发酵时：先在30℃（允许条件） 中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（40℃ ，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。
• 应用举例由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株 Ts88:30℃培养时能正常生长40℃是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）

第97页：抗药性突变株的筛选

• 方法：梯度平板法（gradient plate）
• 4.3.2 抗药性突变株的筛选抗药性突变株的应用：作为菌株的遗传标记作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）

第98页：3抗生素抗性变异株的筛选

4.3.3 抗生素抗性变异株的筛选

第99页：营养缺陷型

• ★与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。
• 如：lys -，bio-野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。
• 如：lys+
• bio+
• 原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。
• 4.3.4 营养缺陷型(auxotroph) 的筛选

第100页：三类培养基

• 与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
• 完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。
• 补充培养基（SM）[x]：在 MM 中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基

第101页：营养缺陷型筛选步骤

营养缺陷型诱变筛选步骤及方法 auxo 的鉴定诱变处理 auxo 的浓缩 auxo 的检出

第102页：方法：将菌培养

• 缺陷型的浓缩①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。
• 方法：将菌培养在含抗生素的 MM 基中

第103页：菌丝过滤法

• ②菌丝过滤法适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝
• auxo 孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过

第104页：逐个检出法缺陷型的检出

①逐个检出法缺陷型的检出

第105页：影印平板培养

②影印平板培养法

第106页：夹层培养

③夹层培养法

第107页：生长谱法•方法

• ①生长谱法•方法简便
• 回变和污染不影响结果•测定物质可为粉末或纸片缺陷型的鉴定测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型
• 第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型

第108页：每组中其他因子应分别出现等要点导览

• 组合营养物法步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a. 将多种营养因子编组
• b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养
• c. 结果分析
• 一组：12 3 4 5 二组：2 67 8 9 三组：3 7 1011 12 四组：4 8 111314 五组：5 9 12 14 15 营养因子分组编排时注意
• 1） 每组内无重复的营养因子2） 每组中应包含只出现一次的因子3） 每组中其他因子应分别出现二次如

第109页：缺陷型检出的分组法

一组：12 3 4 5 二组：2 67 8 9 三组：3 7 1011 12 四组：4 8 111314 五组：5 9 12 14 15

第110页：组合补充培养基法

• ②组合补充培养基法–将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷类型，或快速分离出所需缺陷类型的菌株。
• ABFEDCHG

第111页：营养缺陷型的应用

• 缺陷型的应用作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记
• 作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种
• 作为 aa、维生素、碱基的测定菌株

第112页：而发生回复突变则长

• Ames test：对化学诱变剂做检测菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his -
• 原理：his -在基本培养基上不长
• 而发生回复突变则长

第113页：Ames试验

Ames test 方法示意图

第114页：第三节基因重组的定义

第三节基因重组

凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination） 或遗传重组。

作用

重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。

重组与杂交的关系

重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交而一般所说的杂交（hybridization） 则是细胞水平上的一个概念。

第115页：基因重组形式的比较

微生物中各种形式基因重组的比较重组范围供体和受体的关系整套染色体局部杂合高频率低频率部分染色体个别或少数基因细胞融合或联结性细胞真菌的有性生殖体细胞真菌的准性生殖细胞间暂时沟通细菌的接合性导细胞间不接触吸收游离 DNA 片段转化噬菌体携带 DNA 转导由噬菌体提供遗传物质完整噬菌体溶源转变噬菌体 DNA 转染

第116页：基因重组的意义

• 基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。
• 杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。
• ②利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。
• 杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。
• 到了70 年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展

第117页：基因重组与高产菌株

生长快、产量低生长慢、产量高基因重组生长快、产量高

第118页：原核微生物的基因重组

一、原核微生物的基因重组基因重组的方式转化转导接合原生质体融合

第119页：型活菌的定义

• R 型活菌+S 型死菌→ →S 型活菌定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离 DNA 片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。
• 转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。
• 有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的 DNA 片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子
• （一） 转化（transformation）
• 1、转化及其发现

第120页：转化发生的条件

• ①受体细胞要处于感受态. 感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态②供体 DNA 片段（转化因子） 大小适宜，分子量一般为1×107D 左右③菌株间的亲缘关系密切
• 2、转化发生的条件
• 3、转化的类型根据感受态建立的方式，可以分为：①自然遗传转化 natural genetic transformation②人工转化 artificial transformation

第121页：感受态

• 感受态出现时间：只在细菌生长的某一时期出现
• 不同菌种的感受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae 的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，Bacillus 的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。
• 感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。
• 如用 CaCl2 处理 E. coli 可以诱发其产生感受态。
• 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同.Bacillus subtilis 不超过10~15%Streptococcus pneumonia 和 Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌） 达到100%转化 DNA 的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1gDNA/ml 细胞悬液即可有效发生转化

第122页：感受态因子：细胞外蛋白

• 感受态因子：细胞外蛋白，Streptococcus pneumonia 和 Bacillus 中分离的分子量为5,000~10,000Dalton，可能存在于细胞膜上，可催化外来 DNA 分子的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的 DNA 受体显露出来
• 也可能是一种自溶酶。
• 对不同细菌，每个细胞上的 DNA 结合位点数不同。
• 有人计算，在 H. Influenzae 上有4~10 个，而在 S. Pneumonia 上则有30~80 个。
• S. Pneumonia 的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而 Bacillus subtilis 的感受态因子则无此功能

第123页：转化因子

• 转化因子转化因子：本质是供体 DNA 片段一般的转化因子都是线状双链 DNA
• 也有少数报道认为线状单链 DNA 也有转化作用。
• 大小：经过多次提纯操作后，每一转化 DNA 片段的分子量都小于1×107，即约占细菌核染色体组的
• 0.3%，其上平均约含15 个基因。
• 而粗制的 DNA 则分子量较大。
• 吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10 个转化因子。
• 转化频率：一般只有
• 0.1~1%，最高时亦达10%左右。

第124页：另一个细胞与原始受体菌一样

• 转化的过程以 S. Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株） 为例，大致可分为六阶段：吸附：双链 DNA 片段与细胞表面的特定位点（主要在新形成细胞壁的赤道区） 结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。
• 在吸附过程的前阶段，如外界加入 DNA 酶，就会减少转化子的产生。
• 稍后，DNA 酶即无影响，说明此时该转化因子已进入细胞
• 切割：在吸附位点上的 DNA 被核酸内切酶分解，形成平均分子量为4~5×106 的 DNA 片段
• 入胞：DNA 双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。
• 分子量小于5×105 的 DNA 片段不能进入细胞。
• 这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率
• 重组：来自供体菌的单链 DNA 片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链 DNA 交换、整合和取代，于是形成了一个杂合 DNA 区段（heterozygous region）。

第125页：转化的过程

降解吸附切割成4~5×106 单链入胞同源部分配对、整合复制分裂，只有一个子代 DNA 分子获得供体基因非转化子转化子

第126页：转化的过程

转化的过程 strrstrr

第127页：自然转化的普遍性到目前为止

• 自然转化的普遍性到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：Streptococcus pneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas 和 Xanthomonas 中多见。
• 在若干放线菌和蓝细菌以及 Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa（粗糙脉胞菌） 和 Aspergillus niger 中，也有转化现象。
• 肠杆菌科的一些细菌很难进行转化，主要原因一方面由于外来 DNA 难以掺入到细胞中，另一方面在受体细胞内常存在可降解线形 DNA 的核酸酶。
• 如果用 CaCl2 处理 E. coli 的球状体，就可以使之发生低频率的转化。
• 另外，可利用霉菌的原生质体进行转化。
• 两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。
• 但即使在转化率极高的菌种中，其不同菌株间也不一定都能发生转化

第128页：人工转化

• 人工转化人工转化——是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取 DNA 的能力，或人工地将 DNA 导入细胞内。
• 方法：①CaCl2 处理细胞，使其成为能摄取外源 DNA 的感受态状态.②电穿孔法 electro p oration：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括 DNA ） 能通过这些小孔进入细胞

第129页：可转化的性状

可转化的形状荚膜多糖的合成专一性酶的合成专一性蛋白质的合成抗药性

第130页：转染的定义

• 4. 转染（transfection） 定义：把噬菌体或其它病毒的 DNA（或 RNA） 抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。
• 与转化的区别：病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌中间不发生任何遗传因子的交换或整合最后不产生具有杂种性质的转化子

第131页：转导

转导

[-][-][-]Try-his+Try+his-Try+his+混合培养AB三、转导（transduction）J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。1.转导及其发现

第132页：转导与转导子

• AB[-][-]Try+his+Try-his+Try+his-定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的 DNA 片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。
• 获得新遗传性状的受体细胞，称转导子

第133页：转导的种类

2. 转导的种类完全普遍转导普遍转导流产普遍转导转导转导低频转导局限转导高频转导

第134页：普遍性转导的定义

• 过程：供体菌正常噬菌体+ 完全缺陷噬菌体少量裂解物+ 大量受体菌遗传稳定的转导子（1） 普遍性转导（generalized transduction） 定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。
• 完全(普遍性) 转导：complete transduction。
• 1952 年发现，在 Salmonella ty phi muri um 中存在转导现象。
• 在它的完全普遍性转导实验中：以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌 P22 噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体裂解

第135页：完全普遍转导

完全普遍转导

第136页：普遍性转导

• （1） 普遍性转导（generalized transduction） 过程：P22 在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10 –6 ~10 –8） 噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体 DNA 片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身 DNA 的缺陷噬菌体。
• 供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i）<1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源 DNA 片段导入受体细胞内。
• 在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体
• 而由于导入的外源 DNA 片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子

第137页：感染复数

• 感染复数（m.o.i，multiplicity of infection） 感染复数——由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。
• 每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量,m.o.i 一般很大，可达250~360。
• 由于超 m.o.i 的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为自外裂解（lysis from without）

第138页：噬菌体裂解第一个宿主时可

• 噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1） 包入的完全是噬菌体的 DNA（正常噬菌体）2） 包入的完全是细菌 DNA（完全缺陷噬菌体）3） 部分带有噬菌体基因的 DNA（部分缺陷噬菌体） 转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。
• 噬菌体裂解第一个宿主

第139页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

本页源文件仅提取到章节标题文字，主体为图片内容，其后内容为「交换完成，外源DNA掺入等要点导览」。

第140页：交换完成，外源DNA掺入等要点导览

• 一个稳定的转导子的形成
• 1. 第一次交换
• 2. 第二次交换
• 3. 交换完成，外源 DNA 掺入染色体组中

第141页：流产普遍性转导的定义

• 1.2 流产普遍性转导（abortive transduction） 概念：受体菌经转导获得的供体 DNA 片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。
• 现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源 DNA 分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释. 所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点

第142页：局限性转导的定义

• 2. 局限性转导定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。
• 特点噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因） 该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 –5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体） 分类：低频转导与高频转导

第143页：转导的过程

• 转导的过程该溶源菌被诱导裂解时，有极少数（~10–5） 的前噬菌体（prophage） 发生不正常切离（abnormal ex ce sion），其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如 E.coli 前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的 gal 基因或合成生物素的 bio 基因） 连接到噬菌体 DNA 上（而噬菌体也将相应的一段 DNA 遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体（defectivephage）。
• 它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。
• 温和噬菌体感染受体菌后，其 DNA 会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性

第144页：低频转导（LFT，low

• 2.1 低频转导（LFT，low frequency transduction） 一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（10 –4 ~ 10 –6）。
• 把这种裂解物称为 LFT（低频转导） 裂解。
• 用 LFT 裂解物以低 m. o. i（感染复数） 感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导

第145页：局限性转导

局限性转导

E.coliK12 ()gal+(供体菌)(大量) + dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌) E.coliK12Sgal-/ dgal+E.coliK12Sgal-/ dgal+/ E.coliK12Sgal-/ dgal+/ （双重容源菌供体）(50%) + dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受体菌) E.coliK12Sgal-/ dgal+（转导子）（双重容源转导子）高频转导和低频转导图解低频转导高频转导U.V.U.V.

第146页：双重溶源菌

双重容源菌【E.coliK12(/dg)】①转导噬菌体（dg）+ ②辅助噬菌体（） 转导子菌落噬菌斑 U.V. 附

第147页：高频转导（HFT，hig

• 当用 LFT 裂解物以高 m.o.i 感染 E.coligal–（不发酵半乳糖的营养缺陷型） 菌株时，凡是感染有λdgal 噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的λ噬菌体。
• 这时λ与λdgal 同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌（doublelysogen）。
• 当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdgal 缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。
• 所以在双重溶源菌中的正常λ噬菌体被称为助体（或辅助） 噬菌体（helperphage）。
• 双重溶源菌的裂解物中含有等量的λ和λdgal 粒子，称为 HFT（高频转导） 裂解物。
• 用 HFT 裂解物以低 m.o.I 感染另一个 E.coligal–（不发酵半乳糖的营养缺陷型） 受体菌，就可以高频率地把它转化为能发酵半乳糖的 E.coligal+转导子。
• 是为高频转导
• 2.2 高频转导（HFT，high frequency transduction）

第148页：普遍性与局限性转导比较

比较项目普遍性转导局限性转导转导的基因供体染色体或染色体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生的位置不结合在寄主染色体特定位置上结合在寄主染色体特定位置上获得转导噬菌体的方法通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌转导子的区别一般稳定，非溶原性（不表现出任何噬菌体的性状，包括免疫性） 一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性状） 普遍性转导和局限性转导的比较

第149页：溶源转变的定义

• 3. 溶源转变概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。
• 性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。
• 区别：当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状也随之消失温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身基因使宿主获得新性状温和噬菌体使完整的，不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子

第150页：白喉毒素与溶原转变

白喉毒素与溶原转变

典型实例Cory ne bacterium diphtheriae（白喉棒杆菌）：白喉毒素/温和噬菌体Clostridium botulinum（肉毒梭菌）：C型或D型肉毒毒素Salmonella anatum（鸭沙门氏菌）：细胞表面多糖/E15噬菌体Streptomyces erythreus（红霉素链霉菌）：合霉素合成和气生菌丝形成/P4温和噬菌体

第151页：接合的定义

• （二） 接合（conjugation） 定义：供体菌（“雄”） 通过其性菌毛与受体菌（“雌”） 相接触，前者传递不同长度的 DNA 给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。
• 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant） 研究方法：1946 年 J.Lederberg 等采用 E.coli 的两株营养缺陷型进行实验，奠定了方法学基础
• 也为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。
• 存在范围：细菌：G –较为多见如 E. coli、Salmonella、Shigella、Serratia、Vibrio 、Azotobacter 、Klebsiella 和 Pseudomonas 等最为常见放线菌：Streptomyces 、Nocardia 接合还可发生在不同属的菌种之间，如 E. coli 与 Salmonella typhimurium 之间或 S. typhimurium 与 Shigella dysenteriae 之间 E. coli 的 F 因子：决定性别的质粒，属于附加体（episome），可以通过接合作用获得，也可以通过丫啶类化合物、溴化乙锭或丝裂霉素 C 的处理而消除

第152页：接合及其发现AB

• 接合——两个亲本细胞通过直接接触来转移遗传物质的基因重组方式。
• 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）1946 年用 E.coli 的两个营养缺陷型所作的实验：Met+bio+thr+leu+Met-bio-thr+leu+Met+bio+thr-leu-[Met bio thr leu][-][-][-]混合培养离心洗涤后
• 1、接合及其发现 AB

第153页：研究细菌接合方法

研究细菌接合方法的基本原理

第154页：AB[-][-]过滤器U型管实验

AB[-][-]过滤器 U 型管实验

第155页：接合供体与受体细胞直接接触

• 接合供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递 DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。
• 通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子

第156页：F因子的存在方式

F 因子的存在方式

第157页：第八章微生物的遗传变异与育种章节分隔页

本页源文件仅提取到章节标题文字，主体为图片内容，其后内容为「E.coli的四种接合类型」。

第158页：E.coli的四种接合类型

• 根据 F 因子在 E. coli 中的有无，及与染色体的关系，可将 E. coli 分为四种类型：①F–（“雌性”） 菌株：细胞中不含有 F 因子，细胞表面不具有有性纤毛。
• 可以通过与 F+、F’或 Hfr 菌株接合而接受供体菌的 F 因子、F’因子或 Hfr 菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成 F+菌株、F’菌株或重组子。
• 据估计，从自然界分离到的2000 株 E.coli 中约有30%是 F–菌株

第159页：F+×F–F++F–

• ②F+（“雄性”） 菌株：细胞内含有（1~4 个） 游离的 F 因子，细胞表面存在与 F 因子数目相当的性菌毛。
• 与 F–相接触时，可通过性菌毛将 F 因子转移到 F–细胞中，使之也变成 F+菌株。
• F 因子以很高的频率传递，但含 F 因子的宿主细胞的染色体 DNA 一般并不被转移。
• F+×F–F++ F–

第160页：Hfr与F-的接合

• Hfr×F–H fr + F–（在大多数情况下）Hfr×F–H fr + Hfr （在极少数情况下）③Hfr（高频重组，high frequency recombination） 菌株：含有与染色体特定位点整合的 F 因子。
• 因该菌株与 F–接合后的重组频率比 F+ 菌株高几百倍而得名。
• Hfr 菌株与 F–菌株接合时，Hfr 染色体双链中的一条单链在 F 因子处发生断裂，F 因子位于线状单链 DNA 的两端，整段单链线状染色体从5’端开始等速进入 F–细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120 分钟。
• 由于种种原因 DNA 转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入 F–细胞的机会越大。
• F 因子位于线状 DNA 的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子

第161页：F′×F–F′+F′

• ④F’菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状 F 因子，可与 F–菌株接合，使其成为 F′菌株。
• F′菌株的形成：由 Hfr 菌株中的 F 因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F 因子也缺失一段 DNA. 由 Hfr 异常释放所生成的 F’菌株，称为初生 F’菌株
• 由 F–接受外来 F′因子所产生的 F′叫作次生 F′细胞
• F 因子转导 F mediated transduction:利用 F’菌株与 F–接合可将供体染色体 DNA 传入 F–菌株，从而使 F–既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得 F 因子。
• 这种接合方式叫做 F 因子转导,又称性导 sexduction.——因为 F 因子可在细菌的染色体多位点整合，所以 F 因子转导可实现不同基因的转移和重组。
• F′×F–F′ + F′

第162页：F因子转导

• F 因子转导（F-duction） 通过 F’菌株与与 F–菌株间的接合，就可以使后者转变成 F’菌株，为次生 F’菌株。
• 它是一个部分双倍体，具有一个不完整的 F 因子，缺少部分基因，仍可进行与 F–菌株间的接合。
• 由 F’因子来传递供体基因的方式，称为 F 因子转导、性导（sexduction） 或 F 因子媒介的转导（F-mediated transduction）。
• 图：初生 F’菌株和次生 F’菌株的由来

第163页：原来的供体仍为F+菌株

• 接合的一般过程接合时 F+细胞与 F–细胞相遇，性菌毛与 F–细胞表面发生吸附而形成接合管
• F+细胞内，F 因子的一条 DNA 单链在特定的位点上发生断裂
• 断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5’为先导通过性菌毛推入 F–细胞中，另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到 F–细胞中的那条单链。
• 这种 DNA 复制机制称为滚环模型（rolling circle model）
• 在 F–细胞中，以外来的供体 DNA 线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链 F 因子。
• 至此，原来的 F–菌株变成了 F+ 菌株。
• 原来的供体仍为 F+ 菌株

第164页：接合中断试验与染色体图

• 接合中断试验与染色体图 Hfr 菌株与 F–菌株接合与 F+菌株相似，区别在于 F 因子被分隔在核染色体组两端，F 因子的头先进入受体细胞，然后是核染色体组，只有核染色体组完全进入受体细胞之后，F 因子的尾才能进入受体菌细胞，完成 DNA 的传递。
• Hfr 菌株与 F–菌株的接合随时都可能被中断，所以极少出现转性的结果，而是形成各种各样的重组子。
• 接合中断试验：由 Wollman 和 Jacob 首创（1955），首先认识了原核微生物染色体的环状特性。
• 原理：接合试验的 DNA 转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量 Hfr 性状的 F–接合子，据此，可以选定几种有特定整合位点的 Hfr 菌株，使之与 F–菌株进行接合，并在不同时间使其中断，最后，根据 F–中出现 Hfr 菌株中各种形状的时间顺序（分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图（chromosomemap）。
• 到1983 年 E.coli 染色体上已定位1027 个基因

第165页：接合中断试验

接合中断试验 Hfr 中 F 因子的整合、断裂和转移 abcde

第166页：原生质体融合

• （四） 原生质体融合——pro top last fusion 概念：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant） 的过程，称为原生质体融合。
• 适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。
• 意义：70 年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。
• 原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。
• 发展点：有关原生质体融合的遗传机制，尚未研究清楚，目前还在探索中

第167页：原生质体融合的优点

原生质体融合的优点：可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量

第168页：原生质体融合的主要步骤

原生质体融合的主要步骤选择亲株→ →制备原生质体→→原生质体融合→ →原生质体再生→ → 筛选优良性状的融合重组子

第169页：真核微生物的基因重组

• 二、真核微生物的基因重组主要方式：有性杂交准性杂交原生质体融合（略） 转化（略）
• （一） 有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。
• 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种

第170页：酵母菌的生活史（复习

• 酵母菌的有性杂交育种
• （一） 酵母菌的生活史（复习）
• （二） 酵母菌有性杂交技术酵母菌有性杂交程序一般为：亲本的单倍化↓有性杂交↓杂交后代的检出↓筛选优良性状个体

第171页：亲本的单倍化

1. 亲本的单倍化1) 杂交亲本单倍体细胞的分离 A. 子囊的形成 a. 形成子囊的条件 b. 一般方法 A . 单倍体子囊孢子的分离 a. 显微操作器分离单倍体子囊孢子法 b. 酶法 c. 机械研磨法 B. 单倍体菌株的确定 a. 单倍体细胞与二倍体细胞在形态方面的区别 b. 生孢子能力的测定 c. 单倍体细胞结合型的确定2) 杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作酵母菌有性杂交的方法

第172页：杂交后代的检出4.筛选优等要点导览

• 1. 可口可乐
• 2. 酵母菌有性杂交①孢子杂交法②群体交配法③单倍体细胞杂交法
• 3. 杂交后代的检出
• 4. 筛选优良性状个体

第173页：酵母双倍体与单倍体比较

S.Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较项目双倍体单倍体细胞大，椭圆形小，球形菌落大，形态均一小，形态变化较多液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖较慢，细胞常聚集成团在产孢子培养基上形成子囊及子囊孢子不形成子囊自或然人破工壁破壁减数分裂接合子囊孢子发芽

第174页：准性生殖

• （二） 准性生殖（para sexual hybridization） 定义和意义：类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。
• 为半知菌育种提供了一个重要手段。
• 存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中准性生殖的过程

第175页：准性生殖的过程

准性生殖的过程①菌丝联结②异核体形成（质配）③核配形成杂合二倍体④体细胞交换和单倍体化

第176页：具有野生型性状

• 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长。
• 同核体：同一菌丝中只有一种核。
• 异核体的特点：1） 具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体
• 2） 具有野生型性状，可在基本培养基上生长
• （基因互补功能）3） 大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基上生长
• 如能生长，则为异核体、或为杂合二倍体（重组子）

第177页：体细胞交换和单倍体化

• 体细胞交换和单倍体化杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化） 而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。
• ABA+B（同核体）（异核体）AABBABAABB（杂合二倍体） 单倍体杂合子

第178页：准性生殖与有性生殖的比较

准性生殖与有性生殖的比较项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理上有分化的性细胞独立生活的异核体阶段有无接合后双倍体细胞形态与单倍体基本相同与单倍体明显不同双倍体变单倍体的途径通过有丝分裂通过减数分裂接合发生的几率偶然发现，几率低正常出现，几率高

第179页：准性杂交

准性杂交选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本强制异合：将两菌亲株的分生孢子（106~107） 混合涂[-]平板，并做各单亲本对照，[-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面验稳定性：在[-]夹层平板上培养后，再倒上一层[+]，再培养后若出现大量新菌落，说明是不稳定的异核体，反之是杂合二倍体促进变异：用诱变剂进行处理，以促进染色体发生交换、染色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等，使分离后的子代提高增加新性状的可能筛选

第180页：青霉的准性杂交步骤

青霉的准性杂交步骤

Penicillum urticae 的准性杂交步骤

第181页：菌种的衰退与复壮的概念

• 1. 衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
• 衰退的原因：①基因突变，②分离现象。
• 常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变
• 生长速度缓慢，产孢子越来越少
• 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。
• 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降
• 第四节菌种的衰退、复壮及保藏
• 一、菌种的衰退与复壮的概念

第182页：菌种的复壮

• 2、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。
• 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施
• 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。
• 实际上是利用自发突变（正变） 不断地从生产中选种. 菌种的复壮措施：①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。
• ②通过寄主体内生长进行复壮（如 Bacillus thuringiensis 的复壮）
• ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。
• ④采用有效的菌种保藏方法

第183页：防止菌种衰退的方法

• 3、防止菌种衰退的方法：①控制传代次数（一般在 DNA 的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）
• ②选择合适的培养条件
• ③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）
• ④采用有效的菌种保藏方法

第184页：原理：选用优良的纯种，（等要点导览

• 1. 目的：①存活，不丢失，不污染②防止优良性状丧失③随时为生产、科研提供优良菌种
• 2. 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。
• （其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等） 二、菌种保藏

第185页：菌种保藏的方法

• 菌连续在培养基上（内） 移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内） 移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上
• 3. 菌种保藏的方法

第186页：低温保藏法

• 3、方法：①低温保藏法方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。
• ②石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。
• ③干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。
• 如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年

第187页：真空冷冻干燥法

• ④真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。
• 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。
• ⑤液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。
• 适用于各种微生物的较理想的保藏方法

第188页：菌种保藏机构的任务

• 菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
• 菌种保藏机构中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 国内外菌种保藏机构

第189页：干法保藏菌种的方法

干法保藏菌种的方法滴入小试管（在放入大试管干燥器中） 藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法） 冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒） 球块状载体（硅胶、瓷球） 合适的载体有机基质（曲料、麦粒） 滤纸片薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成） 血清蛋白小片（…乙烯薄膜…）

第190页：几种常用菌种保藏方法

几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6 月6~12 月1~2 年1~10 年5~15 年以上简便简便简便简便有效简便有效