06 第三章 主要实验技术1.1.ppt

第1页：第三章 细胞生物学实验技术

第三章细胞生物学实验技术METHODS AND TECHNIQUES

第2页：本章内容提要

本章内容提要

• 第一节显微技术
• 第二节生物化学与分子生物学技术
• 第三节细胞分离技术

第3页：第一节 显微技术

第一节显微技术

• 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。
• 电子显微镜：以电子束为光源。

第4页：一、光学显微镜

—、光学显微镜

第5页：普通光学显微镜的构成与原理

1.构成：

• ①照明系统
• ②光学放大系统
• ③机械装置
• 2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）普通光学显微镜

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第8页：显微镜的分辨力

• 3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
• R=0.61λ/N．A．
• 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

第9页：几种介质的折射率

下表列出几种介质的折射率，是计算镜口率与评估分辨力的依据。

源文本本页表格为图片未提取到数值，上表为标准参考值，建议对照原课件图片核对后定稿。

第10页：显微镜的几个光学特点

显微镜的几个光学特点：

• 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。
• sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
• 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于

第11页：荧光显微镜

（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope

• 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；
• 有两个特殊的滤光片；
• 照明方式通常为落射式。

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第13页：上皮细胞荧光图

• Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green
• 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

第14页：激光共聚焦扫描显微镜

• （三）激光共聚焦扫描显微境Laser confocal scanning microscope,LCSM
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。
• 能显示细胞样品的立体结构。
• 分辨力是普通光学显微镜的3倍。
• 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

第15页：LCSM实物图

laser confocal scanning microscope, LCSM

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第17页：非洲爪蟾黑色素细胞LCSM图

LCSM Image of a Xenopus Melanophoremicrotubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) http://www.itg.uiuc.edu/

第18页：暗视野显微镜

（四）暗视野显微镜dark field microscope

• 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。
• 可观察4~200nm的微粒子，

第19页：相差显微镜

把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1.环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。2.相位板（annularphaseplate）

第20页：相差显微镜原理图

原理

第21页：相差显微镜的用途

用途：观察未经染色的玻片标本

第22页：偏光显微镜

（六）偏光显微镜polarizing microscope

• 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。
• 光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。
• 载物台是可以旋转。淀粉

第23页：微分干涉差显微镜

• （七）微分干涉差显微镜Differentialinterference contrast microscope（DIC）
• 1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显

第24页：倒置显微镜

（八）倒置显微镜inverse microscope

物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。

第25页：当代显微镜的发展趋势

（九）当代显微镜的发展趋势

• 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。
• 自动化与电子化。

第26页：二、电子显微镜

二、电子显微镜

第27页：扫描电子显微镜

1、作用：观察标本表面结构。（20世纪60年代）

2、分辨力：为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。（一）扫描电子显微镜

第28页：SEM实物图

Scanning electron microscope（SEM）

第29页：扫描电镜的工作原理

3、工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。（为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。)

第30页：扫描电镜原理图

扫描电子显微镜原理

第31页：人类红细胞SEM图

人类红细胞

第32页：酵母SEM图

酵母

第33页：人类精子SEM图

人类精子

第34页：透射电子显微镜

（二）透射电子显微镜

transmission electron microscope, TEM

第35页：透射电镜的构成与分辨力

• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。
• 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
• 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。
• 用于观察超微结构（

第36页：

第37页：TEM实物图

透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRONMICROSCOPE，TEM

第38页：不同光线的波长

下表比较可见光、紫外光、X射线与电子束的波长，用以说明电子显微镜分辨力远高于光学显微镜。

源文本本页表格为图片未提取到数值，上表为标准参考值，建议对照原课件图片核对后定稿。

第39页：超薄切片制样技术

2、制样技术

• 1）超薄切片
• 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。
• 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

第40页：

第41页：负染技术

2）负染技术

用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。Negative Stained Actin

第42页：冰冻蚀刻技术

3）冰冻蚀刻freeze-etching

亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，

第43页：扫描隧道显微镜

（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM

第44页：STM的原理

• 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。
• 分辨率：横向为

第45页：扫描隧道显微镜原理图

扫描隧道显微镜原理

第46页：苯分子在铜表面的STM图

STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu

第47页：三、显微操作技术

三、显微操作技术micromanipulation technique

第48页：显微操作器的使用

• 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。
• 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。

第49页：显微操作仪

显微操作仪