05 第六章 自由基清除剂及其加工技术.ppt

第1页：第六章自由基清除剂及其加工技术教学目标

• 第六章自由基清除剂及其加工技术
• 了解自由基的概念和对人体的危害
• 掌握几种常见自由基清除剂的结构和生理功能
• 了解国内外自由基清除剂的种类及作用机理
• 掌握几种常见自由基清除剂制备的方法和要点

第2页：自由基的概念及其对人体的影响

自由基

任何包含一个或多个未成对电子并能独立存在的原子或基团，如氢自由基、超氧阴离子、羟自由基、烷氧基、氢过氧基、单线态氧等。

过氧化氢不是自由基。

第3页：氧的损伤与氧化应激

• 氧的损伤氧分子轨道有两个未成对电子，很易转变为自由基或活性氧。
• 氧化应激生物体内氧化与抗氧化失去平衡。
• 氧化应激原因营养不良造成膳食抗氧化剂耗竭；活性氧自由基产生过多。

第4页：自由基的动态平衡与膳食建议

• 自由基处于产生与清除的动态平衡体内物质和能量的转化（氨基酸的氧化等）；维持在一个适当水平（破坏细胞结构）。
• 自由基引发并参与脂质过氧化作用。
• 改善膳食（减少脂肪、增加水果蔬菜和谷物），食物抗氧化剂的积累，延迟或预防疾病。

第5页：自由基清除剂的种类

自由基清除剂

食品中的维生素E、维生素C、胡萝卜素、黄酮类化合物、SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等成分，能清除自由基，制止自由基链反应引发的脂质过氧化。

非酶类自由基清除剂

食品中存在的天然抗氧化成分，属于非酶类清除剂。

酶类自由基清除剂

SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等属酶类清除剂。

第6页：抗氧化酶类与非酶类清除剂

• 抗氧化酶能清除活性氧的酶。
• 非酶类清除剂抗氧化剂：食品和药物中的抗氧化成分；自由基清除剂：能清除自由基实现抗氧化作用的物质；

第7页：清除剂起作用的条件

• 自由基清除剂只有在足够浓度时才起作用；
• 清除剂只有在产生自由基的位置附近才能起作用；
• 清除剂与自由基反应后本身会成为新自由基，这个新自由基的毒性应小于原来的才能起防护作用。

第8页：黄酮类化合物的结构

• 第二节黄酮类化合物
• 黄酮类化合物的结构及生理功能
• 黄酮类化合物的结构
• 基本母核：2-苯基色原酮类化合物；
• 黄酮、黄酮醇，人体每天从食物中摄取可达1g；
• 二氢黄酮、二氢黄酮醇类、异黄酮、二氢异黄酮、双黄酮类、查尔酮类、橙酮类、黄烷醇类、花青素、新黄酮类。

第9页：黄酮类清除自由基的机理

• 黄酮类化合物的生理功能
• 清除自由基与超氧阴离子反应阻止自由基反应的引发，与铁离子络合阻止羟基自由基的生成，与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。

第10页：黄酮调节免疫功能与抗衰老

• 调节免疫功能
• 增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性；
• 增加抗体产量，调节体液免疫功能和细胞免疫功能；
• 通过血脑屏障吸收活性自由基，起抗衰老作用。

第11页：黄酮保护心血管系统

• 保护心血管系统
• 能影响血管的脆性和渗透性，改善血液循环状态，增加寇脉流量；
• 选择性地与血管壁上的血栓结合，起抗血栓形成作用；
• 防治血管老化和脑血管供血不足作用；

第12页：黄酮类化合物的抗癌作用

• 抗癌作用
• 致癌物(苯、苯并芘、亚硝基化合物)，由惰性物经生物转化成的高活性物质，能破坏细胞结构，引发疾病，转化中产生一些自由基中间物，进一步形成活性很强的羟基自由基和单线态氧，引发癌症。
• 黄酮类化合物作为寻找有效抗癌活性物质。

第13页：黄酮抗炎保肝与调节内分泌

• 抗炎作用具有抗病原微生物、抗炎症、抗感染作用。
• 保护肝脏作用能促进组织再生，修复内脏器官的病变组织。
• 调节内分泌功能植物激素——异黄酮，具有抗雌激素作用。

第14页：黄酮抗菌抗病毒与解痉作用

• 抗菌及抗病毒作用木犀草素、黄芩素有抗菌作用。
• 解痉作用解除平滑肌痉挛作用，如异甘草素、黄豆甘原。

第15页：黄酮类化合物的制备原料

• 黄酮类化合物的制备工艺
• 原料豆类：大豆；水果类：山楂、葡萄柚、蔷薇果、柑桔、柠檬、红桔、樱桃、李；蔬菜类：花茎甘蓝、洋葱、番茄；沙棘、茶叶、葡萄酒、蜂蜜、啤酒、咖啡；

第16页：减压蒸馏法提取黄酮

• 减压蒸馏法
• 水中有一定溶解度，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯等有机溶剂。
• 用热水浸提出多糖、脂类及黄酮类化合物等可溶性成分，再用有机物溶剂进一步提纯。

第17页：树脂柱纯化法

• 树脂柱纯化法
• 离子交换树脂是一种不溶性高分子物质，对溶液中的离子具有选择吸附能力;
• 适宜的树脂，极性相近的黄酮类被吸附在树脂柱内，得到富集、纯化，用洗脱剂洗脱。

第18页：碱提取酸沉淀法

• 碱提取酸沉淀法
• 黄酮苷类不溶于酸性水，易溶于碱性水;
• 在提取液中加酸，黄酮苷类即可沉淀析出。
• 简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取。

第19页：超声波与超临界CO2提取

• 超声波提取破坏植物细胞壁，使细胞内有效成分大量溶于有机溶剂，提高提取效率。
• 超临界CO2提取

第20页：黄酮类化合物的应用与葛根饮料

• 黄酮类化合物的应用
• 植物提取液直接制取功能食品。
• 提取液经浓缩、分离纯化、干燥，制取高纯度的黄酮化合物，用于食品抗氧化剂和制造功能食品。
• 饮料中应用
• 葛根黄酮功能饮料：20~30倍的水量浸提；

第21页：黄酮在焙烤与小吃食品中的应用

• 精制后的产品，添加入果汁中，再调配。
• 焙烤食品的应用面包、桃酥等。
• 小吃食品的应用冰淇淋、绿豆糊、黑米糊等。
• 其他食品中的应用奶粉、糖果、植物油等。

第22页：酶解-溶剂法提取罗汉果黄酮

• 酶解-溶剂法提取罗汉果中黄酮类物质
• 研究酶法与溶剂提取相结合提取罗汉果中黄酮类化合物的工艺条件；
• 通过正交试验找出纤维素酶法及溶剂提取的最佳工艺条件。

第23页：罗汉果的成分与酶法原理

罗汉果的果实和叶含有罗汉果三萜皂苷，还含有大量的果糖、黄酮类化合物、十多种人体必需氨基酸、脂肪酸、维生素C、微量元素等。

酶法提取：根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁的结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，达到提取细胞内有效成分的目的的提取方法。

第24页：罗汉果黄酮提取工艺流程

罗汉果黄酮提取工艺流程：罗汉果干果→粉碎过筛→乙醇浸提、回收乙醇→石油醚萃取分层→乙酸乙酯萃取、减压浓缩→干燥→罗汉果黄酮粗提物

同时以乙醇浸提中加入纤维素酶作对比试验。

第25页：乙醇石油醚乙酸乙酯的纯化作用

• 无水乙醇沉淀除去溶液中的多糖、蛋白质等大分子物质，石油醚为萃取剂除去溶液中的脂溶性色素等，乙酸乙酯可萃取出罗汉果黄酮。
• 用正交试验确定无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯的用量，确定分离纯化的工艺条件。

第26页：纤维素酶解正交因素水平表

纤维素酶酶解条件正交试验因素水平表：下表列出酶解温度、酶浓度、pH值与酶解时间的三档水平。

第27页：纤维素酶解正交试验结果

纤维素酶解正交试验结果：下表列出九组试验的得率。

说明：原课件K值与极差行内部自洽（A极差1.486＞C 0.711＞D 0.644＞B 0.543，与正文结论一致），但按表中得率重新求和并不吻合（重算A为2.953/3.654/3.476，B为3.094/3.365/3.624，C为3.366/3.153/3.564，D为3.145/3.684/3.254）。此处保留课件原值，建议对照原表核对。

第28页：酶解条件影响因素主次顺序

• 酶解温度影响最大。
• 各影响因素的作用强度依次为：A>C>D>B。

第29页：溶剂提取正交因素水平表

溶剂提取正交试验因素水平表：下表列出乙醇、石油醚、乙酸乙酯与粗提液的体积比水平。

说明：原课件此表数字粘连严重，此处按最自洽方式切分为三组水平；其中水平2的a值“1:18”疑为录入或识别误差，建议对照原表核对。

第30页：溶剂提取正交试验结果

溶剂提取正交试验结果：下表列出九组试验的得率。

说明：原课件K值与极差行内部自洽（c极差4.181＞b 1.171＞a 0.605，与正文结论一致），但按表中得率重新求和不吻合。此处保留课件原值，建议对照原表核对。

第31页：溶剂提取影响因素主次顺序

• 乙酸乙酯用量的影响最大。
• 各影响因素的作用强度依次为：乙酸乙酯>石油醚>乙醇。

第32页：提取物的紫外光谱分析

•提取物的紫外光谱分析

第33页：紫外吸收峰与提取率比较

• 在250nm、320nm处均有吸收峰，在黄酮类化合物紫外吸收范围内，所得的产物为罗汉果黄酮类化合物。
• 该方法的提取率要比一般的提取方法的提取率高。

第34页：酶法与传统提取方法的比较

• 传统的提取方法，温度高，收率低，成本高，消耗大量的溶剂，会造成对环境的污染。
• 酶制剂具有专一性、特异性，在常温、常压条件下就能起催化作用，能有效地提高植物药中的有效成分的含量，减少污染物的排放，能真正实现“绿色中药工业”。

第35页：茶多酚的结构

• 第三节茶多酚
• 茶多酚的结构及其生理功能
• 茶多酚的结构
• 儿茶素类、黄酮、黄酮醇、花青素酚酸、缩酚酸。
• 儿茶素类化合物，占茶多酚总量70%。

第36页：茶多酚清除自由基与免疫调节

• 茶多酚的生理功能
• 清除自由基、增强机体免疫力当L-表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为0.006mg/ml，对超氧阴离子消除率达98%；当浓度为0.1mg/ml，对羟自由基消除率达99.9%。

第37页：茶多酚抗衰老抗辐射与抑菌

• 抗衰老作用提高SOD活性，减低细胞的脂质过氧化物，延缓肌脂褐素形成，起抗衰老延寿作用。
• 抗辐射作用
• 抗癌作用
• 消炎、抑菌及抗病毒作用没食子酸酯有抑制伤寒、副伤寒、霍乱和痢疾

第38页：茶多酚维持血管功能与防龋齿

• 维持正常血管功能
• 防龋齿作用有杀死龋齿细菌。

第39页：茶多酚沉淀萃取法提取

• 茶多酚的制备工艺
• 沉淀萃取法提取
• 水溶液将茶多酚浸提；
• 利用茶多酚能与Bi2+、Ca2+、Hg2+、Sb3+等金属离子产生络合沉淀，将茶多酚从含茶多酚的水浸提液中分离出来；
• 用酸转溶，用乙酸乙酯抽提。

第40页：茶多酚溶剂萃取法

• 溶剂萃取法
• 利用茶多酚及其杂质在不同溶剂中溶解度的不同；
• 用溶剂去杂或抽提。

第41页：茶多酚粗制品的纯化

• 粗制品的纯化
• 粗制品溶于水，用乙醚萃取，乙醚层减压回收，干燥即得较纯茶多酚；
• 水层用乙酸乙酯反复萃取，除去水层，收集乙酸乙酯层；
• 将乙酸乙酯溶液层减压低温浓缩，干燥，得茶多酚初级氧化聚合物。

第42页：茶多酚在饮料与小吃食品中的应用

• 茶多酚的应用
• 饮料茶叶软饮料、发酵酒饮料等。茶多酚添加量为250mg/mL。
• 小吃食品冷冻制品（雪糕、冰淇淋）；糖果（硬糖、奶糖、水果糖、口香糖）。

第43页：茶多酚在糕点食品与茶膳中的应用

• 糕点食品中面包、饼干、桃酥、羊羹、云片等。添加量：茶多酚150~200mg/mg食品
• 茶膳中茶叶挂面、茶叶汤面、茶叶馒头、茶叶紫菜浇饭

第44页：超氧化物歧化酶的分类

• 第四节超氧化物歧化酶
• 超氧化物歧化酶的基本特性及生理功
• 超氧化物歧化酶的组成和分类
• Cu,Zn-SOD，绿色；
• Mn-SOD，紫色；
• Fe-SOD，黄褐色。

第45页：SOD的主要理化特性

• 超氧化物歧化酶的主要理特性
• 等电点pH4~6，偏酸性，酸性蛋白；
• 对热、pH和蛋白水解酶的稳定性好。

第46页：SOD延缓衰老的作用机制

• 超氧化物歧化酶的物化特性和生理功能
• 延缓由于自由基侵害引起的衰老现象自由基引起机体衰老的机制：
• 生物大分子的交联聚合和脂褐素积累；
• 器官组织细胞的死亡和癌变；
• 免疫力降低。

第47页：SOD治疗自由基损伤疾病

• 治疗由自由基损伤而诱发的疾病
• 消除肌肉疲劳
• 提高人体的抵抗力

第48页：SOD的制备原料

• 超氧化物歧化酶的制备
• 原料动物：牛血、猪血、马血、兔血、蛋黄、鸭血、猪肝、牛乳等；植物：剌梨、大蒜、小白菜、饭豆等；微生物：酵母菌。

第49页：沉淀法制备SOD

• 沉淀法
• 热稳定性好，温度低于80℃，短时间热处理酶活力损失不大，一般杂蛋白在高于55℃易变性沉淀。
• 酶蛋白在等电点时，溶液中的静电荷为零，酶蛋白的溶解度最小而沉淀下来。

第50页：有机溶剂分级沉淀

• 粗酶溶液中加入一些弱极性有机溶剂（丙酮），改变溶液的介电常数，使不同种类的蛋白质的溶解度产生不同程度的下降；
• 可以把超氧化物歧化酶和其他的杂蛋白分开。

第51页：离子交换层析法

• 离子交换层析法
• 离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。
• 等电点在4~6之间，pH>7.0时带负电，能被阴离子交换剂吸附，
• 根据离子交换剂对蛋白质结合力差异，用具有一定离子强度流动相进行洗脱，就可和其他杂蛋白分开。经透析，冷冻干燥。

第52页：盐析法原理

• 盐析法和金属螯合亲和层析法
• 盐的浓度增高到一定数值时，水活度降低；
• 蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏；
• 引起蛋白质分子间相互聚集从溶液中析出。
• 一定浓度范围的盐浓度(如1%~25%饱和度硫酸铵)，使部分杂质呈“盐析”(沉淀)状态。

第53页：盐析与盐溶分步分离

• 有效成分呈“盐溶”(溶解)状态；
• 离心分离得上清液，选择一定浓度范围的盐浓度(如25%~60%饱和度的盐溶液)；
• 使SOD呈盐析状态，另一部分杂质呈盐溶状态；
• 离心收集的沉淀为初步分离制备的SOD。

第54页：金属螯合亲和层析

• 亲和层析
• 把对SOD具有识别能力的配体Cu2+以共价键的方式固化到含有活化基团基质如壳聚糖上，然后装入层析柱；
• SOD粗酶液通过该柱量，由于静电引力，结构互补效应等作用使其被吸附，而无亲和力或非特异吸附的物质被起始缓冲液洗涤出来。

第55页：亲和层析洗脱

• 改变起始缓冲液的pH，或增加离子强度，或加入抑制剂等；
• 把SOD解离下来。
• 这一操作可把SOD和杂蛋白分开。

第56页：酵母发酵法制备SOD

• 酵母发酵法
• 酵母菌种进行摇瓶培养；
• 离心收集菌体，悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声波破壁，离心除去残渣，得粗酶提取液；
• 经盐析和柱层析得酵母SOD。

第57页：硬脂酸修饰SOD

安全性毒理学评价程序：按以下四个阶段依次进行。

1. 急性毒性试验
2. 遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验
3. 亚慢性毒性试验（90天喂养试验、繁殖试验、代谢试验）
4. 慢性毒性试验（包括致癌试验）

第58页：糖酯与聚乙二醇修饰

• 糖酯修饰法一定条件下，将葡萄糖酸内酯与超氧化物歧化酶上赖氨酸的ε–氨基结合，提高其稳定性。
• 聚乙二醇修饰法一定条件下，经活化的聚乙二醇对SOD非活性部位上赖氨酸的ε–氨基进行修饰，增强SOD对环境的稳定性。

第59页：SOD的应用与口服有效性

• 超氧化物歧化酶的应用
• SOD作为药物在临床上被广泛应用，研究证明经口摄入SOD是有效的，为SOD应用于功能食品的开发提供理论依据。
• 欧、美、日等发达国家和地区SOD保健食品已被消费者广泛接受。

第60页：SOD保健品

• 保健品
• SOD有清除细胞中超氧阴离子的作用。
• 具有防病、抗衰老的SOD潜在的市场容量及经济价值巨大。
• 国内外已有不少添加SOD的抗衰老的保健品。

第61页：SOD药品的三大作用

• 药品
• 作为药物有三个特殊的作用，抗炎、抗超氧化物和抗病毒。
• SOD是国际医学界公认的唯一能清除人体细胞中自由基的酶，具有极强的抗氧化、防辐射、消炎、防衰老和抗癌作用，治疗高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、肝病等病症效果明显。

第62页：SOD治疗自身免疫病与抗肿瘤

自身免疫性疾病类风湿关节炎，结肠炎，皮肌炎及肺气肿等。特别是治疗顽固性风湿性关节炎、慢性多发性关节炎。

抗辐射、抗肿瘤具有保护DNA，蛋白质和细胞膜，使其免遭O2—引起的破坏作用，用于良性肿瘤辅助治疗、恶性肿瘤预防、防止癌细胞扩散方面及放射治疗后的并发症等。

第63页：SOD抗氧化与延缓机体衰老

• 抗氧化治疗氧中毒，心肌缺氧及某些心血管疾病，用作早产婴儿的氧中毒症的解毒药。
• 延缓机体的衰老生物体内的SOD含量与其寿命有密切关系，SOD能增强免疫力、延缓老年斑的出现、防止和消除色素沉着。

第64页：SOD作为食品添加剂的应用

• 为药用酶，在美国、德国、日本等国已有产品。
• 食品
• 作为食品添加剂用于糕点、饮料等，形成一种独具特色的保健食品。
• SOD奶粉、SOD胶丸、SOD啤酒等；SOD口服液，添加量为5U/mL。牛乳的SOD含量为3.2U/mL。

第65页：SOD可申报的保健功能

• 作为保健食品可申报的功能有：免疫调节、调节血脂、调节血糖、调节血压、抗突变、抗疲劳、抑制肿瘤等。
• SOD苹果原有天然风味和营养成分不破坏的前提下，用微生态生物工程技术对自然生长过程中的苹果进行特殊处理而开发的富集SOD酶的功能苹果。

第66页：SOD苹果的功效与优势

• 食用SOD苹果，对炎症、高血压、心脏病、癌症等疾病及辐射、化疗损伤有预防和辅助治疗作用。
• SOD苹果是SOD功能食品开发方面的一大突破，人们在食用新鲜绿色食品的同时，又获得保健食品疗效，价格又低于一般保健品及口服液、胶囊等。

第67页：SOD在日用化工品中的应用

• 日用化工品
• 日用化工品的成份之一。
• 具有抗氧化，消除色素沉淀作用，改善皮肤细胞的微循环，阻止脸部色斑的形成，祛除细小皱纹，增加肌肤弹性，延缓衰老。
• 对清除面部黄褐斑，黑斑，老年斑有独特效果。
• 添加SOD的化妆品（大宝SOD蜜等）倍受女士们的青睐。

第68页：SOD在烟酒中的应用

• 烟酒
• 香烟经SOD处理，可以去除焦油及尼古丁。
• 报道，日本已生产出低焦油含量的SOD卷烟。