05 第五章 代谢控制发酵的基本思想 （微生物代谢的人工控制）.ppt

第1页：代谢控制发酵的基本思想封面

本页为《代谢控制发酵》第五章「代谢控制发酵的基本思想——微生物代谢的人工控制」封面，标示本章主题。本章讲述人工控制微生物代谢的两类方法：改变微生物的遗传特征与控制发酵条件，并给出丙酮酸、D-核糖、γ-亚麻酸、柠檬酸、赖氨酸等发酵实例。

第2页：人工控制微生物代谢的两种方法

微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多地积累；而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制。

人工控制微生物代谢的方法主要有两种：

1. 改变微生物的遗传特征
2. 控制发酵条件

第3页：第一节 遗传控制

第一节 微生物生物合成途径的遗传控制：本节讲述通过选育营养缺陷型、抗反馈调节突变株等遗传手段改变微生物生物合成途径，使目的产物大量积累。

第4页：图3-1 鸟氨酸生物合成途径

图3-1 谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径：①乙酰谷氨酸合成酶；②乙酰谷氨酸激酶；③N-乙酰谷氨酸醛脱氢酶；④乙酰鸟氨酸转氨酶；⑤N-乙酰谷氨酸-O-乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶；⑥鸟氨酸氨甲酰基转移酶；⑦精氨琥珀酸合成酶。

第5页：瓜氨酸缺陷型积累鸟氨酸

Arg对N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶有反馈调节作用。当选育瓜氨酸缺陷突变株（Cit^-），亚适量添加瓜氨酸（Cit），就会积累大量的鸟氨酸。

第6页：2、分支途径（1）

2、分支途径（1）：本页图示分支生物合成途径的调节特点，以及通过切断支路使目的产物优先积累的育种思路。

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第10页：高丝氨酸脱氢酶缺陷型

例如：谷氨酸棒杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（hom^-）来积累大量Lys。

第11页：二、选育抗反馈调节突变株

二、选育抗反馈调节突变株

所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。

第12页：（一）选育抗代谢类似物突变株

（一）选育抗代谢类似物的突变株（Analogue Resistance Mutant）：通常微生物生长需要各种代谢物，如维生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢终产物如氨基酸A过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶，同时也能整合到蛋白质中去；只有当氨基酸A浓度足够高时，A与调节酶结合才表现调节效应。

第13页：代谢类似物的作用特点

我们说代谢物和调节酶的变构部位或阻遏蛋白的结合是可逆的；而代谢类似物（结构类似物）A′则不同——在培养基中添加A′，其空间结构与A相似，当细胞中大量存在A′时，它也能和A一样与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，发生反馈抑制与阻遏作用。由于A′不能整合到蛋白质分子中去，细胞中的A′浓度不会自行下降。

第14页：抗性突变株的判别

若我们通过诱导等手段获得突变株，已解除了终产物对酶的反馈调节，也就是说终产物A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合，那么A的结构类似物A′也同样不再与调节酶的调节部位或胞质阻遏蛋白结合，也就是A′对菌株的毒害作用表现不出来，我们就说该菌株对A′有抗性（resistance）。

第15页：结构类似物抗性作为筛子

根据上述原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除反馈抑制或阻遏的突变株。在这个意义上结构类似物抗性可以作为解除反馈调节菌株的“筛子”。除了氨基酸外还有嘌呤、嘧啶、维生素等的结构类似物。通过选育这些结构类似物抗性菌株，已获得氨基酸、核苷酸、核苷、维生素等各种代谢产物的高产菌株。

第16页：（二）营养缺陷型的回复突变

（二）从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株：调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能：

1. 是编码催化亚基与调节亚基的基因都发生了变化。
2. 仅仅是编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化。

第17页：回复突变的两种结果

若通过再次突变使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能：一是催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态；另一种是催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这种情况实质上是编码调节亚基的DNA突变，解除了反馈抑制作用。调节酶的失活与否可能直接表现为某种营养缺陷型，可以采用营养缺陷型回复突变的方法来筛选。

第18页：三、产物降解酶缺失突变株

三、产物降解酶缺失突变株：为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后按图示流程筛选。

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第20页：四、增加前体物的合成

四、增加前体物的合成：通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。

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第22页：五、细胞膜组分缺失突变株

五、细胞膜组分缺失突变株：本页说明通过选育细胞膜组分缺失的突变株改变膜透性，使目的产物及时分泌到胞外。

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第24页：第二节 生物发酵条件的控制

第二节 生物发酵条件的控制（外因）：当菌株选育确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）发酵为例来说明：控制发酵条件包括O₂浓度、NH₄⁺浓度、pH、磷酸盐浓度、生物素浓度等；环境条件改变可使代谢转换方向，不生成目的产物而转向其它产物。

第25页：表3-1 环境因素对发酵的影响

表3-1 环境因素对Glu产生菌发酵的影响

说明：本页源文件仅提取到表格标题，未提取到表格行列数据，无法还原为真表格，建议对照原课件图片补充该表的环境因素与对应发酵结果。

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第27页：第三节 代谢控制发酵实例

第三节 代谢控制发酵实例：本节依次给出丙酮酸、D-核糖、γ-亚麻酸、柠檬酸、赖氨酸的代谢控制发酵实例，以及高产乙醇酵母的选育思路。

第28页：一、丙酮酸的用途及生产状况

一、丙酮酸的代谢控制发酵

（一）丙酮酸用途及生产状况：丙酮酸（pyruvic acid）又称α-氧代丙酸、α-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，例如治疗帕金森病的多巴和L-半胱氨酸、L-Leu、B₆和B₁₂的前体。

第29页：丙酮酸的化学法生产

作为一种化工产品，丙酮酸早已实现工业化生产，但是直到20世纪90年代，工业上生产丙酮酸还沿用Howard Frazer（1932）开发的酒石酸脱水脱羧法，没有多大改进。此法是将酒石酸与硫酸氢钾混合在220℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得丙酮酸，工艺简单易行。其主要缺点是丙酮酸产率较低（为酒石酸量的比例不高）。

第30页：发酵法生产丙酮酸的突破

尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业生产要求，而选育高产丙酮酸菌株十分困难。发酵法生产丙酮酸真正取得突破是1988年，日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1989年实现工业化发酵生产，其产酸率最高达67.8g/L。

第31页：（二）酵母发酵生产丙酮酸

（二）酵母代谢控制发酵生产丙酮酸：本页起介绍酵母细胞中丙酮酸代谢的四个关键酶及其辅因子，以及据此设计的代谢控制育种方案。

第32页：丙酮酸代谢的关键酶与辅因子

丙酮酸代谢的四个关键酶及其辅因子如下表：

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第34页：二、D-核糖的发酵机制

二、D-核糖代谢控制发酵

（一）D-核糖发酵机制：本页图示芽孢杆菌中转酮酶缺陷造成D-核糖积累的代谢机制。

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第37页：1、出发菌株的选择

（二）D-核糖发酵的代谢控制育种

1、出发菌株选择：芽孢杆菌属的细菌转酮酶缺陷突变株积累D-核糖具有普遍性；而E.coli属、伤寒沙门氏菌等细菌的转酮酶缺陷突变株并不积累核糖，因此都采用芽孢杆菌属细菌。

第38页：2、转酮酶缺陷突变株的分离

2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育）：

1. 选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，因为D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必须通过磷酸戊糖途径进行代谢，若转酮酶发生缺陷，菌体自然也就不能利用它们。
2. 选育莽草酸缺陷突变株。
3. 选育L-色氨酸^-、L-酪氨酸^-等标记菌株。

第39页：3、其它遗传标记

3、其它标记：在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力的标记，可使D-核糖大量积累。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属细菌孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH₂、NADPH₂会发生分子型的变换，结果在菌体对数生长期被诱导，导致D-核糖大量积累；若形成孢子，D-核糖减少。

第40页：4、利用基因工程育种

4、利用基因工程：日本岩木盾等人首先将枯草杆菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒PUB110中，然后将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活；经限制性内切酶SmaⅠ切后得到线状重组质粒，将该线状重组质粒转化到枯草杆菌宿主菌中，构建转酮酶失活的D-核糖工程菌株，其核糖产量得到大幅提高。

第41页：5、发酵控制

5、发酵控制——发酵培养基：

• 碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。
• 氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、（NH₄）₂SO₄、CaCO₃。

要在好气条件下，pH中性，温度37℃。

第42页：三、γ-亚麻酸代谢控制发酵

三、γ-亚麻酸（r-亚麻酸）代谢控制发酵：本节讲述丝状真菌利用葡萄糖生物合成γ-亚麻酸的代谢途径与高产菌株的选育思路。

第43页：（一）γ-亚麻酸的生物合成途径

（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成γ-亚麻酸的代谢途径：本页图示葡萄糖经EMP、HMP途径提供乙酰CoA与NADPH，再经脂肪酸合成酶系与脱氢酶作用生成γ-亚麻酸的过程。

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第45页：(二)高产菌株的选育思路

(二)高产γ-亚麻酸菌株的选育思路（图3-9）：本页给出选育高产γ-亚麻酸菌株的总体思路，包括出发菌株选择、切断支路代谢、解除反馈调节、强化能量代谢、增加前体等八条路线。

第46页：1、出发菌株的选择

1、出发菌株：多采用被孢霉（Mortierella）、毛霉（Mucor）、红酵母（Rhodotorula）、小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂高的真菌作出发菌株。

第47页：2、切断或减弱支路代谢

2、切断或减弱支路代谢：

• α-亚麻酸^-、花生四烯酸^-、二十碳五烯酸^-
• 花生四烯酸、二十碳五烯酸支路缺陷型的选育

第48页：3、解除反馈调节

3、解除反馈调节：选育脂肪酸结构类似物（如LTBr）抗性突变株、耐高浓度的γ-亚麻酸突变株。

第49页：4、强化能量代谢

4、强化能量代谢：提高菌体细胞内ATP的水平有利于脂肪酸合成。

• 选育呼吸抑制剂（丙二酸、氰化钾、亚砷酸等）抗性突变株。
• 选育ADP磷酸化抑制剂（羟胺、2,4-二硝基酚等）抗性突变株。
• 选育抑制能量代谢的抗生素（寡霉素、结元氨霉素、制霉素）抗性突变株。

第50页：5、增加前体

5、增加前体：菌体生物合成γ-亚麻酸与HMP、EMP途径直接相关。增加HMP途径，NADPH的数量增多，有利于γ-亚麻酸产量的提高；过量的磷酸盐或通气不足会使EMP途径增强，而产生NADPH的HMP途径受阻，导致不饱和脂肪酸的合成降低。

通过选育单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突变株，均有助于γ-亚麻酸产量的提高；另据报道，选育异柠檬酸脱氢酶渗漏突变株也有利于γ-亚麻酸产量的提高。

第51页：6、选育△-6脱氢酶活力强的突变株

6、选育△⁶-脱氢酶活力强的突变株：△⁶-脱氢酶是生物合成γ-亚麻酸的关键酶之一，其活性高低直接与γ-亚麻酸含量的高低密切相关。可采用选育呼吸缺陷型相反的方法，即选育呼吸增强型：诱变后将菌株涂在含有TTC（一种无色的氧化还原剂）的生长培养基上，若△⁶-脱氢酶活力强，即可将TTC还原成红色的物质，红色越深表明菌体细胞内△⁶-脱氢酶越强。

第52页：7、选育低温生长突变株

7、选育低温生长突变株：细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的流动性也就越大，即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育在相对低温（15℃）条件下生长良好的突变株，结果其γ-亚麻酸的产量提高了1.4倍。

第53页：8、选育耐高糖的突变株

8、选育耐高糖的突变株：在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。γ-亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在一定范围内γ-亚麻酸的产量随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长、降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变株，可使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高γ-亚麻酸的产量。

第54页：四、柠檬酸代谢控制发酵

四、柠檬酸代谢控制发酵：2001年以来世界柠檬酸的产量为100万吨左右，2004年我国柠檬酸产量达45万吨，其中80%出口，已经成为世界柠檬酸生产和销售大国。

我国柠檬酸发酵水平：薯干粉产酸12%，发酵周期64h，转化率95%；玉米粉液化液产酸15%，发酵周期54～64h，转化率95%以上。

第55页：(一)黑曲霉生物合成的途径

(一)黑曲霉生物合成柠檬酸、有机酸及多元醇途径：本页图示葡萄糖经不同分支生成柠檬酸、草酸、葡萄糖酸与多元醇的代谢网络。

第56页：途径中的九个酶促步骤

途径中的酶促步骤：1、葡萄糖氧化酶；2、内酯酶；3、己糖激酶或葡萄糖激酶；4、P-葡萄糖异构酶；5、果糖运输；6、己糖；7、1-P-甘露（糖）醇脱氢酶；8、1-磷酸甘露（糖）醇磷酸（酯）酶；9、甘露（糖）醇脱氢酶。

第57页：1、葡萄糖氧化酶受pH影响

1、葡萄糖氧化酶是胞外酶，直接受环境pH的影响。当pH＜3.5时此酶失活；一旦柠檬酸积累使pH降至1.8，就会导致葡萄糖氧化酶失活。

第58页：2、草酸的生成与pH调节

2、草酸是由草酰乙酸水解酶催化生成的，该酶是细胞质酶，草酰乙酸水解酶的生物合成也受外界pH值调节。尽管其调节机制现还没有搞清楚，但是研究表明诱导此酶的最适pH值为5～6，而当pH为2时仅观察到非常低的酶活性。过去采用糖蜜、孢子接种发酵时pH太低，不利于孢子萌发，一般发酵前期控制pH 5～6。

第59页：3、多元醇的生成与去路

3、多元醇（甘露醇、赤藓醇、丙三醇〈甘油〉）是由糖生成的，一旦糖类底物被耗尽，它们就会遭到再次分解，因此只要糖类底物最终能全部消耗，多元醇就不可能是影响柠檬酸最终产量的主要因素。

综上所述，高产Aspergillus niger柠檬酸产生菌应该在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠檬酸发酵水平已达到国际先进水平。

第60页：（二）黑曲霉合成柠檬酸的机制

（二）黑曲霉生物合成柠檬酸机制：本页图示黑曲霉高产柠檬酸的代谢机制，包括关键酶活性、pH与Mn²⁺等因素对柠檬酸积累的影响。

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第63页：五、赖氨酸的生物合成途径

五、赖氨酸代谢控制发酵

（一）赖氨酸生物合成途径及调节机制：微生物合成Lys的途径主要有两种：

1. 在霉菌和酵母中，L-赖氨酸是经α-氨基己二酸途径合成的。

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第65页：酵母中同型柠檬酸合成酶

酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶（HSⅠ、HSⅡ），它们都受Lys相同程度的反馈抑制，HSⅠ较易受L-Lys阻遏。薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功酶，但只有HSⅡ受Lys反馈抑制。解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其HS强烈受Lys反馈抑制。

第66页：2、细菌的二氨基庚二酸途径

2、在细菌、蓝藻、绿藻中存在另一条重要的途径：是以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（DAP）生物合成L-Lys，称为天冬氨酸途径，亦称α,ε-二氨基庚二酸途径。E.coli和黄色短杆菌（谷氨酸棒杆菌等Glu产生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代表性。在大肠杆菌合成Lys的天冬氨酸途径中，含有三种ASP激酶。

第67页：大肠杆菌途径的三点有利特征

1. 没有发现对ASP激酶（AK）或天冬氨酸半醛脱氢酶的反馈阻遏。
2. Lys分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受Lys的反馈抑制，也不受Lys的阻遏，这对Lys的积累十分有益。
3. 未发现Lys脱羧酶，有利于生产Lys。

综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等作为赖氨酸生产菌。

第68页：(二)谷氨酸产生菌的调节机制

(二)谷氨酸产生菌的赖氨酸生物合成调节机制：本页图示乳糖发酵短杆菌等谷氨酸产生菌中赖氨酸分支途径的调节特点。

第69页：图3-13 赖氨酸合成的调节机制

图3-13 乳糖发酵短杆菌赖氨酸生物合成的调节机制：1、丙酮酸羧化酶；2、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；3、天冬氨酸激酶；4、DDP合成酶；5、DDP还原酶；6、高丝氨酸脱氢酶；7、高丝氨酸激酶；8、琥珀酰高丝氨酸合成酶；9、苏氨酸脱氨酶。

第70页：赖氨酸合成的调节特点

1. 优先合成：Met比Thr、Lys优先合成，Thr比Lys优先合成，HD酶活为PS酶活的15倍。
2. AK受Thr+Lys协同反馈抑制。
3. Lys和Leu代谢互锁，PS受Leu阻遏。
4. 乙酰CoA和…平衡合成。
5. Glu优于Asp合成。

第71页：(三)高产Lys菌株的育种思路

(三)高产Lys菌株的育种思路：本页图示高产赖氨酸菌株的育种路线，包括选育营养缺陷型切断支路代谢与选育结构类似物抗性突变株解除反馈调节。

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第77页：（四）细胞工程与基因工程育种

（四）采用细胞工程和基因工程选育高产Lys菌株：1.细胞融合选育高产Lys菌株。本页图示通过原生质体融合与重组DNA技术进一步提高赖氨酸产量的思路。

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第81页：高产乙醇酵母的选育思路

高产乙醇的酵母菌的选育思路——呼吸缺陷型突变株的筛选

如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试验，但结果表明该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现有生产菌株的50%。请写出如何改造你新分离的酵母菌株，使其优于现有生产菌株的方案。

提示：呼吸抑制发酵——在低糖（0.2%）条件下筛选呼吸缺陷型突变株。

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