页数：150页文件大小：3.30 MB来源： 代谢控制发酵ppt课件
本课件系统讲述微生物的代谢调节机制，涵盖酶合成的诱导、终产物阻遏与弱化、分解代谢物阻遏，以及酶活性的别构与共价修饰调节、能荷调节和代谢产物分泌的调节，并说明各项机制在工业育种中的应用。
本页为《代谢控制发酵》第三章「微生物的代谢调节机制」封面，标示本章主题。本章依次讲述微生物细胞中代谢调节的部位与举措、酶合成的调节机制、酶活性的调节机制、能荷的调节以及代谢产物分泌的调节。
第一节 微生物细胞中代谢调节的部位与举措。本节依次讲述原核微生物细胞的代谢调节部位、真核微生物细胞的代谢调节部位、两类生物在基因表达上的区别，以及微生物细胞代谢调节的主要举措。
一、原核微生物细胞的代谢调节部位：原核微生物的代谢调节主要发生在与细胞质膜密切相关的部位，以及细胞空间内酶分子的数量与活性两个层面。
（一）与细胞质膜密切相关的调节：
（二）细胞空间内存在的酶分子的数量及它们活性的调节：
二、真核微生物细胞的代谢调节部位：本页图示真核微生物细胞中代谢调节的发生部位，其突出特点是细胞器分区造成代谢途径的区域化。
三、原核生物和真核生物在基因表达上的重要区别：本页对比两类生物在基因表达（转录与翻译的时空关系、调控层次、mRNA加工等）上的主要差异。
四、生物进化与代谢调节机制的出现，随生物进化依次出现：
五、微生物细胞的代谢调节的主要举措：
第二节 酶合成的调节机制。本节依次讲述诱导作用、酶合成的阻遏和弱化、分解代谢物阻遏以及转录后的调节。
酶合成调节机制主要有：
（一）诱导机制（操纵子转录）
每个操纵子（元）至少由4个基因（部分）组成：
（1）调节基因（Regulatory gene）：能编码调节（阻遏）蛋白，现发现有两种调节蛋白：
（2）操纵基因（Operator gene）：是操纵子中一个成员，它能控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因可受调节基因产生的阻遏物所阻遏；许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或一个以上（多个）结构基因。
（3）结构基因（Structural gene）：是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在的一个或多个基因，它编码不起调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。一部分结构基因的RNA合成速度精确地被控制，但许多结构基因以一种（或多或少）不变的速度持续地转录DNA上的遗传信息，生成相应的信使RNA（mRNA）。
（4）启动基因（Promoter gene）：启动子（基因）含有两个和RNA多聚酶结合的顺序，一个集中在RNA多聚酶起始位置前约10个碱基对，另一个则集中在这个位置前35个碱基对。当RNA多聚酶与启动子接触并结合上去，mRNA合成即开始；如阻遏物（阻遏调节蛋白）与操纵基因结合，则转录被阻止。
2、DNA与蛋白（阻遏蛋白）的结合：蛋白质与核酸的相互作用一般可分为两类——非专一性，蛋白质可以结合到核酸的任何部位；专一性，蛋白质结合到特定的核酸部位。
（二）酶合成的诱导（转录的负控诱导和正控诱导）实例及机制：下面分别以大肠杆菌乳糖操纵子和麦芽糖操纵子说明负控诱导与正控诱导，并给出阿拉伯糖操纵子的调控机制。
实例（1）酶合成的负诱导机制——大肠杆菌乳糖操纵子：本页图示 lac 操纵子的负控诱导过程，诱导物与阻遏蛋白结合使其脱离操纵基因，RNA聚合酶得以转录结构基因。
（2）转录的正控诱导——麦芽糖操纵子：本页图示正控诱导过程，调节蛋白作为激活因子与特异位点结合后促进RNA聚合酶的转录启动。
机制：转录的正负诱导调控——当大肠杆菌细胞以阿拉伯糖作为生长所需碳源和能源时，它们产生三种将阿拉伯糖转化为木酮糖的酶。
图2-12 阿拉伯糖对ara操纵子araC位点的调控作用：本页图示 AraC 蛋白以 Cr（阻遏型）与 Ci（诱导型）两种形式，分别结合操纵区 A、B 位点实现对 ara 操纵子的正负双重调控。
（三）诱导物的种类：诱导分解代谢酶类属于诱导酶的范畴。例如，淀粉酶是由淀粉诱导合成的，蔗糖酶与脲酶分别由蔗糖和尿素诱导。细胞在代谢过程中生成的产物也可以作为诱导物——荧光假单胞菌在色氨酸大量存在时，色氨酸的代谢产物犬尿酸便可诱导分解色氨酸的酶系。
（四）诱导调节的克服：只有需要时才合成所需的酶是微生物应有的、正常的调节机制，如不设法绕过这种机制，就难于使所需要的诱导酶大量生产。据此可采用诱变方法，借强力因素诱变引起突变，消除诱导酶合成所必需依赖诱导物的障碍；如突变不是发生在结构基因上，而是发生在调节基因或操纵基因上，就会导致调节基因编码的阻遏物（阻遏蛋白）失活或不能结合。
组成型突变株的获得、富集方法：
二、酶合成的阻遏和弱化（终产物的阻遏、弱化）实例及机制：下面以色氨酸操纵子为例说明转录的负控阻遏与转录衰减（弱化作用）。
(一)实例（1）转录的负控阻遏——L-色氨酸操纵子的结构：图2-14为大肠杆菌 trp 操纵子，本页图示其启动区、操纵区、前导区与五个结构基因的排列。
trp operon阻遏系统——终产物的阻遏机制：本页图示终产物色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合后，结合到操纵基因上阻止转录启动的过程。
(2)转录的衰减（弱化作用）弱化子：随着对 trp operon 的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致。例如，在高浓度和低浓度下观察到 trp operon 的表达水平相差约600倍，然而阻遏作用只可使转录减少70倍。显然 trp operon 表达的这种控制与上述阻遏物的控制无关，必须有一种称为弱化作用的调控机制。
（二）机制（1）转录弱化作用的调控：
（2）阻遏作用和弱化作用的区别与协调
那么细菌中为什么还需要弱化子调控系统呢？其原因可能是：
为什么还要阻遏体系呢？没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。当然His操纵子中没有阻遏体系，只有弱化子调节——这说明弱化子的调节作用是控制转录的终止、使转录调控更精细，是阻遏调控体系的次级调节。
三、分解代谢物阻遏（catabolite repression）调控：本节讲述分解代谢物阻遏的概念、实质、cAMP对酶合成水平的控制、葡萄糖对cAMP水平的调节、分子机制、阻遏的克服以及操纵子的复合调控。
（二）分解代谢物阻遏的实质：分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了cAMP。
(三) cAMP是对酶合成水平的控制：
若CRP基因失活的突变株，就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因而只能在易被利用的基质上生长。若腺苷酸环化酶丧失的突变株，则cAMP水平下降，就不能在受阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖）上生长；但它和CRP缺陷突变株不同，外源加入cAMP还是有效的。
(四)葡萄糖对细胞内cAMP水平的调节：
（五）分解代谢阻遏的分子机制：本页图示分解代谢物阻遏在分子水平上如何通过cAMP-CAP复合物、RNA聚合酶与启动区的相互作用实现。
（六）分解代谢物阻遏作用的克服：
（七）转录中的几个操纵子的复合调控作用——营养状态对操纵子活性的影响
（1）lac operon中：
（2）阿拉伯糖操纵子中：下面分别说明有葡萄糖无阿拉伯糖、无葡萄糖无阿拉伯糖、无葡萄糖有阿拉伯糖三种营养状态下 ara 操纵子的表达情况。
A.当有葡萄糖而无阿拉伯糖时：因为葡萄糖的存在使cAMP水平低，所以无cAMP-CAP，又无阿拉伯糖，则细胞内AraC蛋白以Cr型结合到A位点上，因此Pc基本上不与RNA多聚酶结合，只产生少量的AraC蛋白。在有葡萄糖存在时，阿拉伯糖操纵系统没有必要处于活化状态，事实上也处于静态状态，虽然不是完全被关闭，但也是最大限度地受到抑制。
B.因为无诱导物ara，尽管cAMP-CAP、CRP与操纵区位点结合，AraC蛋白仍以Cr（Cpr）形式为主，无法与操纵区B位点结合，无AraBAD的mRNA转录。当无葡萄糖又无阿拉伯糖时，若cAMP量增加，cAMP-CAP位点被占据，Cr仍使AraC蛋白保持在最低浓度的水平。
C.当无葡萄糖、有阿拉伯糖时：大量的Ara基因产物是以Ci（Pi）形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合；无葡萄糖时cAMP-CAP位点也被占据。在cAMP-CAP的共同作用下使AraC和AraBAD基因大量表达，操纵子充分激活。
四、转录后的调节：前边讲的酶合成的诱导、终产物的阻遏或弱化、分解代谢物的阻遏都是在转录水平上的。本节讲述转录水平之后的调控。
（一）遗传控制：下面分别介绍细菌基因的转录和转译的可能调节位点，以及真核生物的基因表达调控。
1、细菌基因的转录和转译的可能调节位点：本页图示细菌基因在转录起始、转录终止、mRNA稳定性与翻译起始等环节上可能的调控位点。
2、真核生物基因表达调控：真核生物的基因表达调控可发生在转录后、翻译及翻译后多个层次。
转录后水平的调控：
（二）信号传导和二组分调节系统：二组分系统是细菌感受并响应外界信号的重要调控方式。
二组分系统由二种不同蛋白质组成：
传感激酶在与膜外环境的信号反应过程中本身磷酸化，磷酰基团被转移到应答调节蛋白上。
（三）细菌的应急反应/紧缩响应（stringent response）：
2. ppGpp的生理功能：关于ppGpp和pppGpp的作用原理尚不清楚，目前认为：
3、ppGpp对核糖体蛋白质合成的影响：前边已介绍了ppGpp对转录的调控，即在氨基酸短缺的情况下，首先被停止合成的是rRNA；而核糖体是由rRNA和核糖体蛋白质构成的，是翻译遗传密码的唯一场所。rRNA的量骤然下降，核糖体蛋白质失去了结合对象而成为多余的了，进而通过某些核糖体蛋白的mRNA调控使其合成停止。
第三节 酶活性的调节机制（蛋白质水平上的调节）：本节讲述酶活性的调节及其影响因素、激活与抑制，以及别构调节与共价修饰两类机制。
酶活性调节的影响因素：
二、酶活性调节机制：酶活性调节机制有多种理论解释，主要有：
1、别构（变构）酶的结构和特性：
2、变构酶活性调节类型（模型）：主要有莫诺德等人的协同模型与科仕兰等人的顺序模型两类。
3、变构酶的反应动力学性质：变构酶的反应动力学不同于普通酶，它不符合米氏动力学方程式。
式中 V 为酶促反应速度，Vmax为最大反应速度，S 为底物浓度。
变构酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，有协同性；当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时不具有协同性；当效应物浓度超过某个水平（阈值）时，酶反应速度急剧增大（减小），即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值，这在代谢控制上具有很大的生理意义。
4、变构酶调节的实例：E.coli的天冬氨酸转氨基甲酰酶，简称ATCase，是以构象转变进行反馈抑制的典型例子，它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个反应，即催化ASP与氨基甲酰-P之间的转移而合成氨基甲酰天冬氨酸。此酶受末端产物CTP的反馈抑制，为ATP所激活。
5、变构酶调节的特征：Monod、Changeux与Jacob认为变构酶调节有以下特征：
（二）酶的共价修饰——共价调节酶：共价修饰是酶蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解离，使其活性改变（导致调节酶活化或抑制）以控制代谢的速度和方向，这是一种快速、灵敏、高效的细调方式。从酶蛋白质中除去或加入的小化学基团可以是磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基，而蛋白质共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH。
这些酶由于小化学基团（磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基等）对其酶蛋白质结构进行共价修饰，使其结构在活性（高活性）和非活性（低活性）之间转变。已知有多种类型的可逆共价修饰蛋白（酶），它们是：
例2：E.coli中谷氨酰胺合成酶就是这样一种共价调节物，本页图示其通过可逆共价修饰在活性与非活性状态之间转变，从而调节氮代谢的方向与速度。
2、不可逆共价修饰：本页图示酶蛋白经蛋白水解酶有限水解、切除部分肽段而由无活性形式转变为有活性形式的过程，这种修饰不可逆转。
3、共价调节酶调节的特点：
第四节 能荷的调节
E.coli生长期间能荷为0.8，静止期为0.5，低于0.5时死亡；Asp.niger柠檬酸生产菌生长期能荷为0.85，而产酸期为0.8。
另外一个度量细胞能量状态的参数是磷酸化位：磷酸化位=[ATP]/[ADP][Pi]。磷酸化位除决定于腺苷酸外，还决定于无机磷浓度；磷酸化位与能荷相比各有特点。
在某种意义上，可把ATP当作糖代谢的末端产物。当ATP过量时会对合成ATP的系统产生反馈抑制；当ATP分解为ADP、AMP、Pi并将其能量供给合成反应时，ATP生物合成的反馈调节被解除，ATP又得以合成。因此，能量不仅调节生成ATP的分解代谢酶类的活性，也能调节利用ATP的生物合成酶类的活性。
二、能荷调控的实例
2.巴斯德效应的本质：本页从能荷角度说明巴斯德效应的实质——有氧条件下ATP生成增多、能荷升高，反馈抑制糖酵解关键酶（如磷酸果糖激酶），从而使发酵速率下降。
（二）补偿控制系统的调节：草酰乙酸的合成受几种产物的反馈调节。若CDP、CTP浓度升高，ATC酶受抑制导致Asp积累，Asp过量又抑制PC酶，草酰乙酸浓度下降。然而TCA环的运转必须有草酰乙酸，为了不使草酰乙酸缺乏，这就需要补偿激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
（三）抗生素发酵中，能荷对次生代谢的调节：在四环素的生物合成中，以丙二酸单酰CoA为前体，在菌体内丙二酸单酰CoA的合成有两条途径：一条是磷酸烯醇式丙酮酸生成乙酰CoA，再在乙酰CoA羧化酶催化下生成丙二酸单酰CoA；另一条是在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化下，由PEP→草酰乙酸→丙二酸单酰CoA。
TCA环运转状况调节了四环素的合成。当TCA环酶活性高时，葡萄糖完全氧化产生大量ATP，过量的ATP对PEP羧化酶有反馈抑制作用，使草酰乙酸生成量减少；同时过量的ATP对柠檬酸合成酶有反馈抑制作用，柠檬酸、异柠檬酸合成减少，而柠檬酸、异柠檬酸对草酰乙酸脱羧酶有激活作用。由于上述两方面的作用，控制着四环素的合成。
还发现在四环素的合成阶段，低产菌株的TCA环酶系活性比高产菌株高2～5倍，因此在生产中采用：
三、不产生ATP的呼吸侧链的发现：微生物利用葡萄糖在好氧条件下生长或发酵的过程，实际上包括以下三个过程：
最近研究发现在Asp.niger柠檬酸产生菌和谷氨酸棒杆菌中，在柠檬酸发酵过程中，除了有上述的正常呼吸链外，还发现不产生ATP的侧呼吸链。此侧链对氰化物、制霉素敏感，Asp.niger柠檬酸产生菌中它对水杨苷氧肟酸敏感。
如果我们通过诱变等选育具有较强呼吸旁路系统的菌株，那么菌种代谢生成的NADH可较多地通过此侧链将氢交给O2，既满足菌种生存，又减少ATP生成，这样就减轻ATP对糖代谢关键酶和柠檬酸、谷氨酸生成酶系的反馈抑制作用，更有利于高产柠檬酸、谷氨酸。
第五节 代谢产物分泌的调节
（一）氨基酸的分泌：对于微生物细胞的氨基酸分泌机制尚不够清楚。一般认为，无论哪种微生物，细胞内氨基酸库中最多的是谷氨酸（G-细菌细胞未发现有游离的氨基酸），因此正常培养下微生物有少量氨基酸（尤其是Glu、Asp）分泌，在霉菌和细菌培养液中发现有1mg/mL左右。
与氨基酸吸收的情况一样，氨基酸分泌机制因菌种及氨基酸种类而异，其中谷氨酸产生菌的谷氨酸分泌已进行了大量研究，其机制概括如下：
（二）核苷酸分泌：核苷酸是不易分泌出细胞外的。实验证明Mn2+对产氨短杆菌核苷酸分泌起关键作用——Mn2+可引起细胞形态的变化，在IMP发酵中控制Mn2+（限量）造成细胞膨胀的不规则形态，膜产生异常，非常专一性的膜透性被破坏，核苷酸生物合成补救途径酶系（PRPP激酶、Hx等）受到影响。
（三）蛋白质（酶）的分泌：不论是原核还是真核生物，在细胞质内合成的蛋白质需定位于细胞的特定区域或者分泌出胞外。也就是说，基因表达不仅是把DNA转录成RNA、RNA翻译为蛋白质，还要实现把合成的蛋白质精确地输送或分泌到位。这是近年来分子生物学研究的一个十分活跃的领域，因为这不仅是基因表达调控的理论问题，而且与生物工程工业化生产有关。
由此可见，疏水的信号肽对新生肽链跨越膜及固定在膜上起一个拐棍作用。没有信号肽及其穿膜转化，蛋白质就只能在膜内而不能向外分泌。
分泌的启动和抑制的调控，目前只知与一种称为信号识别颗粒（Signal recognition particle，简称SRP）有关。其作用是能与核糖体结合并停止蛋白质合成，它阻止翻译发生在肽链延长至约70个氨基酸残基长度时，这个长度正好是信号肽完成从核糖体出来时的长度（跟随信号肽后的30～40个氨基酸残基）。
二、代谢产物分泌的控制：前边已经在代谢产物分泌中谈到氨基酸、核苷酸、蛋白质等产物的分泌是通过改变膜的透性来实现的。本节主要围绕改变膜透性的几种调节方式。
（一）膜脂质组成或含量：本页说明通过改变细胞膜的脂质组成或含量来调节膜透性，从而影响代谢产物的分泌。
（二）改变细胞壁结构来提高膜透性
1、肽聚糖的合成。肽聚糖的重复基本单位由N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸和肽链三部分组成：
（4）组装和运载：N-乙酰胞壁酸-五肽和N-乙酰氨基葡萄糖是在细胞中合成的，在细胞膜上组装并被运送到细胞膜外组成新壁。这两个过程涉及一个非常重要的糖基载体脂（Glycosyl Carrier Lipid，简称GCL）；因为它参与G-菌脂多糖分子的侧链（即抗原决定部分）的合成，所以也称抗原载体脂。
抗原载体脂（antigen carrier lipid，简称ACL）存在于细胞膜上，它的长的非极性烃链插在脂质双分子层的非极性区，而分子的极性末端（磷酸根一端）则是游离状态，作为细胞质水相中的多糖装配单位的受体，并且像手臂一样把它共价结合着，把已在细菌胞膜内侧形成的多糖单位转运到膜的外面，组成肽聚糖、脂多糖等细胞表层的聚糖复合物。
（5）肽聚糖的交联：平行线形聚糖链之间的交联有两种方式：
2、抗生素的作用位点
（1）磷霉素是PEP的结构类似物，它能与UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-3-烯醇式丙酮酸转移酶的一个半胱氨酸残基共价结合，干扰了UDP-N-乙酰胞壁酸的合成。
（2）D-环丝氨酸是D-Ala的结构类似物，它能竞争性地抑制Ala消旋酶和D-Ala-D-Ala合成酶；它对Ala消旋酶的亲和性比D-Ala和L-Ala都要大，因此它阻遏了L-Ala→D-Ala消旋反应和D-Ala-D-Ala添加到UDP-胞壁酸上的反应。
（3）O-氨甲酰-D-赖氨酸能竞争性地抑制Ala消旋酶，导致UDP-MurNAc-三肽加不上D-Ala-D-Ala生成五肽而积累；但它并不能抑制D-Ala-D-Ala合成酶。
（4）杆菌肽：下面说明杆菌肽A通过螯合二价金属离子而阻断糖基载体脂循环的作用机制。
杆菌肽A是由12个氨基酸组成的多肽抗生素，其分子中的L-半胱氨酸的巯基和L-异亮氨酸的羧基反应形成一个噻唑环；在这两个氨基酸的N之间能够螯合二价金属离子（Zn2+、Ca2+、Mg2+等），而ACL-P-P可与螯合的金属离子结合，于是三者形成复合物，因此ACL脱磷酸后使ACL-P不能循环返回。
（5）青霉素、头孢霉素等β-内酰胺类抗生素：它们的作用位点是抑制肽聚糖链交联过程中的转肽作用，导致细胞壁合成受阻。
青霉素分子的β-内酰胺四元环是带有张力的，因此这个环的肽键具有高活性，这个肽键很容易断开；断开时青霉素分子的空间结构和转肽酶的底物R'-D-Ala-D-Ala（五肽末端的二肽）很相似，因而竞争性抑制转肽酶。
（6）衣霉素：下面说明衣霉素干扰肽聚糖装配的作用机制。
衣霉素是一类含葡糖胺的核苷抗生素。它在G+菌中干扰肽聚糖、磷壁酸和壁醛酸的装配，在真核生物中干扰蛋白质的糖基化；它参与ACL+UDP-HexNAc→HexNAc-P-ACL的合成反应，干扰了肽聚糖的装配和合成。
通过上述抗生素阻遏肽聚糖合成，从而使细胞壁合成受阻，形成不完全的细胞壁，由于细胞内外渗透压的作用，使细胞膜透性改变，有利于代谢产物分泌。
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