03 第一章 蛋白质的结构与功能3.pptx

第1页：第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析

第五节蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification andStructure Analysis of Protein

第2页：一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中

• 一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。
• 透析(dialysis)
• 超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

第3页：二、丙酮沉淀

二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质浓缩方法

• 使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
• 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

第4页：免疫沉淀法

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

第5页：三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质

三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。

根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

第6页：几种重要的蛋白质电泳:

• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。
• 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。
• 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。
• 几种重要的蛋白质电泳:

第7页：四、应用相分配或亲和原理

• 四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
• 层析(chromatography)分离蛋白质的原理

第8页：蛋白质分离常用的层析方法

• 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。
• 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。
• 蛋白质分离常用的层析方法

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第11页：五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同

五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离

• 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
• 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。

第12页：因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系

因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。

第13页：六、应用化学或反向遗传学方法可分析

六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

第14页：通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列

通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列

第15页：离子交换层析分析蛋白质

离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分人血红蛋白双向肽图肽的氨基酸末端测定法

第16页：七、应用物理学

七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定

• 二级结构测定通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。α-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而β-折叠的CD谱不很固定。

第17页：三级结构测定X射线衍射法

三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。

第18页：同源模建

• 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。
• 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。
• 从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。
• 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：