页数：116页文件大小：8.60 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件系统讲解DNA的复制：从半保留复制的实验证据入手，介绍大肠杆菌与真核生物的DNA聚合酶、引发体与复制体组装，说明复制起点识别、复制叉推进与冈崎片段连接，并讨论端粒的补齐模式与复制调控。
第四章DNA复制(DNA Replication)
第一节基本概念第二节复制概况第三节DNA复制的酶学第四节DNA复制的半不连续性第五节原核生物DNA复制（E.coli）第六节真核生物DNA复制
第一节基本概念( Basic Concept )
复制体（Replisome）The multi protein (30±) structure thatassembles at replicating fork to undertakesynthesis of DNA复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA
DNA复制在细胞周期的S期E.coli 37℃0.5 h105bp/minmammalian cell500-5000 bp/min
第二节复制概况( Surveys of Replication )
DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication）1958 Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子
N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNA未标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度N15－DNA 1.742g/mlN15－N14－DNA 1.717g/mlN14－DNA 1.710g/ml
复制起点、方式和方向1、复制起点（origin ori或o复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点即－－整个染色体只有一个复制单位
真核生物（Eukaryote）:多复制起点即－－一个genome中有多个复制单位
Replication fork
富含AT &发夹结构“呼吸作用”十分明显许多酶的结合位点300 bp±真核生物的复制原点AT rich
复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点2、复制方向（复制过程的顺序性）复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛
真核生物的多复制子多个复制眼
单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉单向复制双向复制
复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）
复制方式大多数以对称方式进行－－即两条链同时复制也有一定时期内DNA只复制一条链的情况（1）从新起始（de novo initiation）或复制叉式（replication fork）比较形象的－－θ复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像希腊字母θ，因而叫….
A replication eye forms a theta structure incircular DNA.
单、双向θ复制模式图单向复制双向复制
置换式（Displacementform）又称D环复制两条链的合成高度不对称,一条链迅速合成出互补链,另一条则形成游离的单链环(D-环)线粒体和叶绿体DNA的复制方式
共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rolling circlereplication）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制病毒、细菌因子
第三节DNA复制的酶学(Enzymology of DNA Replication)
DNA聚合反应和聚合酶1957 Arthur Kornberg首次发现DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ（E.coli）聚合反应：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→Poly(核苷酸)n+1－3’-OH＋2Pi
三种DNA聚合酶的结构和功能（P112）
其中DNApol Ⅲ全酶有十种共22个亚基β二聚体－－滑动钳
DNApolⅢ全酶的非对称二聚体
DNApolⅠ和DNApol Ⅲ的主要特性和功能1、DNA聚合酶活性：两者都有条件－－模板、引物DNApolⅠ－－主要用于DNA的修复和RNA引物的替换DNApol Ⅲ－－DNA链的延长聚合方向：5’－3’
’－5’外切核酸酶活性校对功能(proofreading)
’－3’外切核酸酶活性DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三个特点：♦必须有5’－磷酸末端♦被除去的核苷酸必须是已经配对的♦被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移，Nick translation）
该反应具有巨大的实用价值，切口平移是体外在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的主要技术
子链DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长5’ OHT C AT C AC5’ OH 3’ppp OHC++ ppiP123页
如果DNA的延伸方向是3’ → 5’A T C G+5’ ppp OH 3’Gppp OHGA T C G5’ ppp OH 3’
A T C G+5’ ppp OH 3’Gppp OHG5’ pppa、因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有pppppp OH 3’A T C G在0.2M NaCl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端需要其他机制以解脱
b、碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗AT C Gppp OH+pppApOHT C GpppOHT C GT C GpppOH
DNA连接酶（DNA Ligase）所需条件：a、切刻的3’－OH和5’－P相邻b、切刻各自碱基处于配对状态c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）用途：复制过程中，5’端RNA引物被置换后切刻的连接修复、重组NAD——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
酶-AMP复合物形成酶复合物的AMP和缺口的5‘-磷酸相连，随后与此缺口的3’-OH形成磷酸二酯键，并放出酶和AMP
第四节DNA复制的半不连续性（Semi-Discontinuous Replication）
岗奇片段（Okazaki fragment）1968用dT-H3短时间来标记大肠杆菌D.S. DNAS.S. DNA蔗糖密度梯度离心测定H3-T放射强度得到许多长度为1kb左右的DNA片段
先导链是连续复制的后随链按Okazaki片段不连续复制 先导链（leading strand）：DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以3’→5’链为模板，按5’→3’方向连续合成的一条链 后随链（lagging strand）：冈崎片段(Okazakifragment): DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段
E.coli[Rifs]RNApol[RifS]+ M13E.coliM13+S.S. DNA virus+RF无M13 RFRifalmpinM13Rifalmpin有M13 RF Rifalmpin是E.coli RNA polymerase的抑制剂
M13RF的形成需要RNA polymerase发动合成一段RNA分子作为引物（RNA提供复制的3‘端） RF启动后，Rifalmpin的抑制无效结论（Conclusion）：
实验证据Ⅱ：Reiji等的实验证据－－每一冈崎片段都产生一个RNA－DNA接头
后续研究发现：♦细菌中先导链的合成受Rifalmpin的抑制♦后随链的合成不受Rifalmpin限制（1）原因：♫先导链的起始需要RNApol的转录激活♫而后随链的起始由引发酶合成引物，而引发酶不受Rifalmpin的抑制
DNA复制的转录激活(transcriptional activation）：DNA复制起始时通过RNApolymerse的转录过程而解开局部的双链转录激活时产生的RNA能否作为引物目前尚未得出普遍结论P119页
RNApol (RNA polymerase) [ RifS]（2）dnaG (primase) [RifR]组装成引发体完成对后随链（先导链）引物的合成（3）完成10±NtRNA引物合成后DNApo lII进行DNA链的延伸DNApolⅠLigase主要实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断4、总结：
RNA primedDNA replication
Removal of RNAprimers and fillingof gaps
引发体（包括引发酶）pppRNA引物DNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase
第五节原核生物DNA复制(DNA replication inProkaryote)
DNA复制机构的研究利用突变表型来考察基因的功能但只能利用条件型突变温度敏感突变体材料: E.coli或噬菌体
DNA复制的起始起始方式：a、从头起始（denovo initiation）:θ复制、D环复制、线状DNA的复制b、共价延伸（covalent extesion）滚环复制
OriC in E. coli chromosomal DNA1、oriC与E.coli复制的起始（从头起始）♦四个9bp的重复序列dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列
简单起始过程a、涉及主要酶系：DnaA（复制起始）、RNApol是必不可少的，此外涉及到DnaB（解旋酶）、DnaC（引发体组分）、Hu蛋白、Gyrase、SSB、DnaG（引物酶）、TopІ和DNApolШ全酶
b、简单步骤：*转录激活*DnaA识别并结合复制起点，DnaB－DnaC六聚体与oriC形成预引发体*DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA*引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装
DnaASSB13bp repeats涉及转录激活
E.coli细胞加倍时间与复制起始加倍时间37℃ < 20min～10h复制时间：40min左右（850核苷酸／秒）分裂过程中其它事件约需20min（组分、隔膜）因此－－加倍时间少于60min的细胞两轮复制有共用时间
共价延伸方式（covalence elongation）ФX174的若干正链的合成起始－－滚环复制过程
延伸过程进入的标志：DNApolШ把第一个核苷酸加到引物的3’－OH端（一）后随链合成的起始（前体片段的起始）后随链的第一个冈崎片段起始于先导链进入延伸之后Φx174 phage后随链的起始（负链合成、不连续合成）P117页
Φx型引发体的组装以PriA识别引发体组装位点（primosome assembly sitepas）开始，首先形成预引发体预引发体与引物酶结合形成了引发体Φx型引发体或其部分组分可沿单链DNA移动到每一个冈崎片段的起点PriA提供引发体移动的动力
位于复制叉处的多酶复合体（引发体）必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段 In lagging Strand上多酶系统必须完成多次反复的启动与扩展E.coli启动2000—4000次的冈崎片段复制
Φx 174 DNA的复制a、SS→ RF，即以（＋）链为模板（－）链的合成Φx型引发体起始后，由DNApolⅢ、Ⅰ和连接酶等协同合成（后随链的起始过程）b、多拷贝RF的合成（滚环复制）（先导链的合成过程、后随链合成）c、后代单链（SS）DNA的合成,即以RF的(－)链为模板，合成(+)链，先导链的合成（DNA复制过程是上一过程的一部分）
A蛋白（gpA）：♦Φx 174基因A的产物♦结合到RFⅠDNA的复制原点的结合位点（引发体的帮助）♦诱导相邻的识别位点的熔解(富含A/T)♦其核酸内切酶活力切割（＋）链的4305与4306碱基的酯键，并共价连接于5’端（A），另一端为自由的3’－OH（G）Rep蛋白－－解旋酶
复制体
复制叉处的复制体（三）前导链和后随链的协同合成聚合酶Ш全酶前导链后随链螺旋酶引发体引物引发酶活性中心一活性中心二PriA清除SSB提供引发体移动动力极性3‘→5’
分子的DNA pol III.协同合成前导链和后随链
复制终止1、环形DNA复制的终止a、终止序列E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白序列一：terE terD terA序列二：terF terB terC每个区域只对一个方向的复制叉起作用
b、专一性终止蛋白E.coli中由tus gene编码（terminus utilization substance）通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用每次复制时只使用一个终止位点ter
细菌(E.coli)DNA每个细胞周期只复制一次
线性DNA的末端复制的问题
环状DNA复制是否存在这样的问题,为什么
线状DNA的复制5’末端短缩的解决模式a、从开始就采取环化的形式－－－λ噬菌体b、象T7噬菌体一样采取连环分子的形式利用自身线性DNA末端的重复序列－－通过末端互补形成连环分子c、最直接的办法－－－引入蛋白质直接从末端起始复制如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰质炎病毒d、痘病病毒的末端由发夹结构连接复制完成后错切连接
聚体3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHT7噬菌体的末端复制专一性核酸内切酶
复制起始复合体引发复制（不需引物）避免5’-end shortentpTp-Ser-dCMPCG 过程SSB + ATPDNA末端解链TPpTP-Ser +dCTPpTP-Ser-dCMP3‘ OH
腺病毒DNA复制起始G
IRIR长的发夹结构痘病病毒末端复制的解决方式－－－－P122
复制忠实性的保证1、DNApol的3’5’外切酶活性(exonucleaseactivity)2、DNApol只能从引物的3’端延伸DNA（需要RNA引物）a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高，且不易校正b、RNA引物最终被降解而避免错误3、后随链的不连续合成因其有利于错配碱基的校正
真核生物DNA的复制(DNA replication in Eukaryote)
复制概况a、多个复制元（multiple replicon），双向复制b、复制元相对较小(13-900kb),复制速度较慢,大约500~5000bp/min（3000bp/min）冈崎片段100～200NTc、复制终止通过复制叉的相遇而终止
真核生物的DNA聚合酶α、β、δ、ε、γ五种位置核内核内核内核内线粒体合成与引发修复合成合成,修复复制功能酶结合前导链后随链3’－5’校NO NO Yes Yes Yes正活性αβδεγ
真核生物DNA复制的引发酶 DNApolα+ primase形成紧密的复合物6-9 Nt RNA as primer 引发酶（primase）：50-60kd 作用方式为阵发性的，每次作用拷贝6～15个核苷酸 既能利用rNTP，又能利用dNTP SV40体外DNA复制情况分析
εδ
真核生物的复制起始受许可因子的控制4、逆转录酶自学（P127）
真核生物染色体DNA末端补齐模式(1)端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ (富含G链)3’AACCCCAACCCCAACCCC5’ (富含C链)
补齐过程通过TG链的回折形成发夹结构（G·G氢键）－－－尺蠖模型→→实现端粒酶位置的调整
G G hoogsteen氢键三螺旋DNAG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGC链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGGt t g g g g tt gC链--A2C4-----AACCCCAAg g g g ttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGC链--A2C4-----
真核生物复制过程中的核小体结构（1）组蛋白的合成在细胞核中与DNA复制同步进行（2）且组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链
组蛋白八聚体以全保留方式传给子代（4）组蛋白八聚体与先导链结合新老八聚体在子代链上的分布复制原点老新先导链后随链
a、复制子的大小（Sizes of replicon）:Yeast or fly平均40 kbMammals平均100 kbProkaryotic DNA:>1000 kbb、冈崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic DNA:100-200 ntc、复制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物DNA复制的比较
Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5.校正阅读（Proofreading）1.复制起点（单、多）2.复制子（大小、多少）3.复制周期的重叠与否4.复制叉移动的速度(900/50 nt/S)5.冈崎片段的大小6. DNA聚合酶Polymerases相同点：不同点：
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