18 分子生物学精要.docx

第1页：第一章 绪论目录

第一章绪论preface 5一、分子生物学的含义 5二、分子生物学的主要研究内容 5三、发展中的分子生物学 5理论上的三大发现 5技术上的3大发明 6近半个世纪以来医学，化学中重大突破与成就 7应用生物学发展 8四、分子生物学资源库 8第二章核酸的结构和功能 8核酸的研究历史和重要性 8第一节细胞中的遗传物质 8一、细胞核内的遗传物质 9二、细胞质内的遗传物质 9第二节DNA的组成 10DNA的一级结构 10第三节DNA的二级结构(双螺旋结构)学习要求:重点掌握 10一、双螺旋结构提出的前期重要工作 10二、B-DNA双螺旋结构 10五、DNA的双螺旋结构的意义 11第四节A-DNA，B-DNA，Z-DNA比较学习要求：掌握 11第五节DNA的变性和复性 11一、DNA的变性 11二、DNA的复性renaturation 12三、分子杂交 13第七节DNA的精细结构学习要求:了解 13第八节超螺旋DNA 14超螺旋结构的方向性 14DNA的变化情况： 14DNA超螺旋结构形成的意义 14二、拓朴异构酶 14第九节染色质的结构学习要求：重点掌握 15组蛋白（Histones） 15第十节DNA的限制图谱和序列分析 15一、限制性内切核酸酶 15二、DNA的序列分析 16第三章基因与基因组 17第一节基因和基因组概述 17一、基因的概念 17二、基因组genome 17第二节病毒基因和基因组 18一、病毒核酸的类型 18二、病毒基因与基因组的特点 19第三节原核生物基因与基因组 19一、原核生物核基因和核基因组的特点 19二、质粒 19第四节真核生物基因与基因组 201

第2页：本章内容目录

• 真核生物基因和基因组的特点 20二、间隔基因 20三、细胞器基因组 21四、真核生物基因组DNA序列组织 21（一）DNA复性的动力学 21（二）真核生物重复序列的类型 22五、基因家族（genefamily） 23第五节基因组学 23一、结构基因组学（structuralgenomics） 241遗传图谱（geneticmap） 242物理图谱的构建 24二、功能基因组学 25第四章DNA的复制和修复 25第一节DNA复制概貌 25DNA的半保留复制 25DNA复制过程的顺序性 25第二节DNA的复制酶和相关蛋白 25一、DNA的聚合反应和聚合酶 25二、引物酶 26三、解螺旋酶，旋转酶 26四、连接酶 26第三节E.coliDNA的复制学习要求:掌握 261,DNA复制的起始 27第四节真核生物DNA的复制学习要求:一般掌握 28真核生物DNA的复制的一些特点 28一、细胞周期(cellcycle) 28二、多个复制原点 29第五节DNA的损伤和修复学习要求:一般掌握 29一、DNA损伤的来源 30二、DNA突变 30三、DNA修复 31第五章DNA重组 32第一节同源重组Homologousrecombination同源重组指由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程
• 同源重组的分子模型 33二、细菌的基因转移与重组 331、细菌的接合作用 342、遗传转化 343、细菌的转导 344、细菌的细胞融合 34三、大肠杆菌重组的分子基础 341、RecA蛋白 342、RecBCD酶 343、RuvABC 34在复制叉处重组水平的ＤＮＡ修复第二节位点特异性重组 35一、λ噬菌体DNA的整合与切除 351、整合反应 352

第3页：本章内容目录（续）

• 切除反应（excision） 36二、细菌的特异位点重组 36第三节Transposition(转座作用）基因组可通过获得新序列而进化，也可通过现存序列的重排实现这一目的
• 无论是原核生物还是真核生物，转座子或转座元件（transposonortransposableelement)的移动提供了基因组变化的潜在可能
• 转座子（transposon，Tn） 36二、转座子的类型和结构特征 37二、转座子的转座机制 37三、转座子转座的特征 37四、转座子的某些遗传学效应 38五、真核生物的转座因子 38第四节逆转录转座子 38第六章RNA的合成 38第一节概述 38第二节RNA的结构和种类 39第四节原核生物RNA聚合酶 39一、RNA聚合酶的结构 39二、RNA聚合酶的识别功能与启动子 40一、RNA合成的起始 40二、链的延伸 41三、RNA合成的终止 41第六节真核生物RNA的合成 4
• 真核RNA聚合酶 4
• 真核生物的启动子 4
• 真核生物转录过程 42第六节转录产物的加工 421真核mRNA前体的加工 432rRNA前体的加工 433tRNA前体的加工 43第七节RNA的剪切机制 431RNA的自我剪接与核酶 432蛋白质（酶）参与的剪接内含子 44第七章蛋白质的生物合成 45第一节mRNA和遗传密码 45一、遗传密码 45二、mRNA 47第二节tRNA与氨基酸 47第四节蛋白质合成的辅助因子 48第五节原核生物蛋白质的生物合成 48一、氨基酸的活化 48二、多肽链合成的起始 49三、肽链的延长 49四、肽链合成的终止与释放 49五、多核糖体 49六、原核生物蛋白质合成的抑制因素 50第六节真核生物蛋白质的生物合成 50一、真核生物蛋白质合成的起始 50

第4页：本章内容目录（续）

• 肽链的延伸和终止 50第七节蛋白质折叠与多肽链的修饰 51一、蛋白质折叠 51二、蛋白质的修饰 51第八节蛋白质的易位与分泌 51蛋白质易位有二个主要途径： 52第八章原核细胞基因表达的调控 52第一节基因表达调控概述 52一、基因表达的基本概念 53二、真核和原核生物基因表达的特点 54第二节原核生物基因表达调控 54一、操纵子学说 54二、乳糖操纵子 55三、色氨酸操纵子 56四、基因表达翻译水平的调节 57第九章基因表达调控 58第一节真核基因表达调控 58一、真核基因表达调控概述 58二、染色质水平的调控 59三、DNA水平的调控 601DNA甲基化与去甲基化 602基因丢失 613基因扩增 614基因重排 61（三）转录水平的调控 611Britten-Davidson模型 612顺式作用元件(cisactingelements) 613反式作用因子(transactingfactors) 624调控蛋白（反式作用因子）与DNA结合的方式 62真核启动子（顺式作用元件）和转录因子（反式作用因子） 641RNApol I的启动子和转录因子 642RNApol III的启动子和转录因子 643RNApolII的启动子和转录因子 64
• RNAPOLII和通用转录因子组成基础转录装置 655RNA聚合酶II的上游元件及其转录因子 656诱导型因子和应答元件 66
• mRNA前体的可变剪接 668反式剪接（trans-splicing） 669RNA编辑（RNAediting） 66翻译水平的调控（translationalcontrol） 67

第5页：第一章 绪论preface

• 第一章绪论preface一、分子生物学的含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域
• 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广泛的前景
• 分子生物学在含义上有两种划分:一种是广义的分子生物学：蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的范畴，即从分子水平阐明生命现象和生物学规律
• 种是狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控等过程，当然也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究基因的分子生物学
• 生命科学课程分子生物学：从分子水平理解生命活动细胞生物学：从细胞水平理解生命活动遗传学：从遗传角度理解生命活动生物化学：从化学组成角度来理解生物大分子和生物代谢
• 普通生物学（动物&植物）&微生物学：不同生物类型的特点二、分子生物学的主要研究内容（一）核酸的分子生物学（二）蛋白质的分子生物学(三）分子生物学技术三、发展中的分子生物学分子生物学发展的三大支撑学科CellbiologyGeneticsBiochemistryCharlesDarwin达尔文物种起源originofspecies1859Mendel孟德尔植物杂交试验Experimentsinplanthybridization1865Miescher米歇尔发现核素Isloationofnuclein1869A.Kossel（德）首先分离到A、T和组氨酸Mitosis有丝分裂1879Planthybridization植物杂交试验1900Meiosis减数分裂1902Morgan摩尔根果蝇试验Flyexperiment19111944肺炎双球菌转化试验Transformation证实DNA是遗传物质噬菌体功能1952HersheyPhagefunction1953 WastonandCrick理论上的三大发现
• 40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA
• 50年代，Walson-crick提出了DNA结构的双螺旋模型，搞清楚了生物遗传的分子机制
• 60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→protein1956 moleculardisease分子病sickle cell anemia镰刀型贫血病(镰刀型贫血病血红蛋白仅一级结构)：β6Glu换成β6Val

第6页：半保留复制

• DNAReplicationDNA半保留复制1962年WSzybalski和ESzybalski用人类DNA去转化人类细胞,发现Ca2+有刺激DNA转移入细胞的作用，是人工转移遗传物质给其它细胞的第1次尝试
• 5年,Jacobf基因操纵子.1968年,NirenbergM,遗传密码.1967年Nirenberg提出遗传工程可用于人类的基因治疗
• 世纪60年代分子生物学作为一门独立学科正式出现
• 8ThefirstrestrictionnucleasecharacterizedwasisolatedfromHaemophilusinfluenzaebacteria.第一次从细菌中分离出核酸酶1972recombinantDNA首次重组DNA试验技术上的3大发明
• “基因剪刀”—限制性核酸内切酶发明
• 载体（“车子”）－基因工程（技术）诞生的第2个技术准备
• 1970年，Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学的中心法则，使真核基因的制备成为可能
• 年代初Graessmann和Dicumako莫定了用显微注射法转移基因
• 2年Grahant等对磷酸钙介导的DNA转移过程进行了详细的研究，使这技术能被普遍接受和应用
• 2年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子,2种病毒DNA的重组1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验基因工程的开始1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)somatostatin生长素释放抑素1975SangerandGilbertHowToSequenceAGene化学法和酶法测序DNA1977discoveriesofsplitgenes.1982基因数据库建立GenBankishousedattheNationalCenterforBiotechnologyInformation.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/1983遗传病的分子机理ThechromosomallocalizationoftheHuntington'sdiseasegeneisthefirststepinusingrecombinantDNAtechnologytoidentifytheprimarygeneticdefectinthisdisorder.1983PolymeraseChainReactionPCR技术建立1986Theproper study ofmankind对人类基因组开始进行研究1987CloningintoaYeastArtificialChromosome(YAC)CloningintoaPlasmid酵母人工染色体建立可以克隆大片段DNA1990 HumanGenomeProject1995Thecompletenucleotidesequence(580,070basepairs)oftheMycoplasmagenitaliumgenome.完成一种支原体基因组序列测定1997The NationalHuman GenomeResearch国际间人类基因组研究1997TheCompleteGenomeSequenceofEscherichiacoliK-12完成大肠杆菌基因组序列测定1998APhysicalMapof30,000HumanGenes30000个人类基因的物理图谱1999TheDNAsequenceofhumanchromosome22完成人类第22号染色体基因序列测定90年代

第7页：人类基因组计划的启动

• 基因诊断技术渐趋成熟\基因治疗合法化\人类基因组计划的启动\分子生物学各分支学科的建立与发展2000The human genome itself must be freely available to allhumankind人类基因组本身必须向全人类开放The Era ofGenomics
• 0)近半个世纪以来医学，化学中重大突破与成就NobelPrize从20世纪50年代起，分子生物学领域的研究成果共获得40项诺贝尔医学-生理科学奖，说明分子生物学在生命科学研究中的重要性2000年，瑞典科学家阿尔维德·卡尔松(ArvidCarlsson)、美国科学家保罗·格林加德(PaulGreengard)、奥地利科学家埃里克·坎德尔(EricRKandel)因在人类脑神经细胞间信号的相互传递方面获得的重要发现，而共同获得诺贝尔医学及生理学奖
• 2001年，美国科学家利兰·哈特韦尔（LelandH.Hartwell）、英国科学家蒂莫西·亨特(TimothyHunt)、保罗·纳斯(PaulNurse)因发现了细胞周期的关键分子调节机制，而共同获得诺贝尔生理学及医学奖
• 2年，美国科学家约翰·芬恩(JohnB.Fenn)、日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)、库尔特·维特里希(KurtWüthrich)因发明了对生物大分子进行确认和结构分析、质谱分析的方法，而共同获得诺贝尔化学奖
• 英国科学家悉尼·布雷内(SydneyBrenner)、约翰·苏尔斯顿(JohnESulston)、美国科学家罗伯特·霍维茨(RobertHorvitz)因选择线虫作为新颖的实验生物模型，找到了对细胞每一个分裂和分化过程进行跟踪的细胞图谱，而共同获得诺贝尔医学及生理学奖
• 3年，美国科学家彼得·阿格雷(PeterAgre)、罗德里克·麦金农(RoderickMackinnon)因在细胞膜通道方面做出的开创性贡献而共同获得诺贝尔化学奖
• 美国科学家保罗·劳特布尔(PaulC.Lauterbur)、英国科学家彼得·曼斯菲尔德(SirPeterMansfield)因在核磁共振成像技术领域的突破性成就而共同获得诺贝尔生理学及医学奖
• 4年，以色列科学家阿龙-西查诺瓦(AaronCiechanover)、阿弗拉姆-赫尔什科(AvramHershko)和美国科学家伊尔温-罗斯((IrwinRose)，因三人因突破性地发现了人类细胞如何控制某种蛋白质的过程，具体地说，就是人类细胞对无用蛋白质的“废物处理”过程，而共同获得诺贝尔化学奖
• 美国科学家理查德·阿克塞尔(RichardAxel)和琳达·巴克(LindaB.Buck)因在人类嗅觉方面的卓越成就而共同获诺贝尔生理学或医学奖
• 5年，澳大利亚巴里-马歇尔(BarryMarshall)和罗宾-沃伦(J.RobinWarren)因发现了幽门螺杆菌以及该细菌对消化溃疡病的致病机理而共同获诺贝尔生理学或医学奖
• 6年,美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛因为他们发现了ＲＮＡ（核糖核酸）干扰机制而被授予诺贝尔生理学或医学奖
• 7年,诺贝尔生理学或医学奖授予来自美国的马里奥·卡佩奇、奥利弗·史密斯和来自英国的马丁·伊文思因胚胎干细胞研究获该奖项
• 这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊荣的
• 这些发现导致了一种通常被人们称为“基因打靶”的强大技术

第8页：细胞信号转导机理生命过程是一个多层次

• 细胞信号转导机理生命过程是一个多层次、连续的整合过程
• 基因和分子研究是认识生命过程的深入层次，这个层次的研究结果对于基因后生命现象如生理表现，病理表现，病生理表现，具有重要意义
• 生命科学中一些最重要的课题需要分子生物学渗入，如细胞生长、分化、衰老，凋亡，个体发育和神经活动等研究
• 分子生物学与这些研究活动结合在一起，形成新的生长点和新的边缘学科应用生物学发展生物技术诊断试剂治疗药物植物品种环境工程食品加工生物塑料废物处理再生能源四、分子生物学资源库核酸资料库主要有GenBank，EMBL，DDBJ
• GenBank是NIH的基因序列数据库，是所有公开的DNA序列的集合，是美国生物技术信息中心（NCBI）建立并维护的，是世界上的权威序列数据库
• 蛋白质资料库主要有：SWISS-PROT，PDB，SCOP，CATH，ExPASy，PIR等
• ExPASy是ExpertProteinAnalysisSystem的缩写，从字面理解即为专业蛋白质分析系统
• ExPASy由瑞士生物信息学研究所维护，提供从序列（Swiss－Prot）到结构(Swiss-Model)，以及2－DPage等蛋白质操作相关的全套服务
• 第二章核酸的结构和功能核酸的研究历史和重要性1869Miescher从脓细胞的细胞核中分离出了一种含磷酸的有机物，当时称为核素（nuclein）,后称为核酸（nucleicacid）
• 此后几十年内，弄清了核酸的组成及在细胞中的分布
• 4Avery等成功进行肺炎球菌转化试验
• 2年Hershey等的实验表明32P-DNA可进入噬菌体内，证明DNA是遗传物质
• 3Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的迅猛发展
• 核酸的研究历史和重要性1958Crick提出遗传信息传递的中心法则，60年代RNA研究取得大发展（操纵子学说，遗传密码，逆转录酶）

第9页：细胞核遗传雌雄配子的核遗传物质相等

• 叶绿体中
• 细胞核遗传雌雄配子的核遗传物质相等，而细胞质遗传物质主要存在于雌配子中
• 细胞核和细胞质的性状表达主要通过体细胞进行的
• 细胞核遗传物质的载体（染色体）有均分机制，遵循三大遗传定律
• 细胞质遗传物质的载体（具有DNA的细胞器如线粒体、叶绿体等）没有均分机制，而是随机的
• 细胞核遗传时，正反交相同，即子一代均表现显性亲本的性状
• 细胞质遗传时，子一代的性状均与母本相同，即母系遗传，正反交不同
• RNA作为遗传物质一些病毒采用RNA作为遗传物质，通过复制其互补链来遗传，利用宿主细胞为其合成包装外壳蛋白
• 除了传统意义上的遗传物质外，还有一种朊病毒蛋白，开创了蛋白本身作为遗传物质的新领域一、细胞核内的遗传物质染色质是遗传物质存在形式，染色质以两种状态存在，按其形态表现和染色质性能区分为常染色质（euchromatin）和异染色质(heterochromatin)
• 核酸（nucleicacid）是构成染色质的基本化学成分之一，它的结构单元是核苷酸（nucleotide），由于核苷酸中戊糖种类的不同，天然存在的核酸可分为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）两类
• 细胞质内的遗传物质细胞质（cytoplasm）是细胞质膜以内、细胞核以外的部分
• 由均质半透明的胞质溶胶（cytosol）和细胞器及内含物组成
• 细胞器包括：线粒体、内质网、内网器（高尔基体）、溶酶体、微丝、微管、中心粒等
• 这些细胞器均是互相分隔的封闭性区室，各具备一套独特的酶系，执行着专一的生理功能

第10页：本相似的性状

• 本相似的性状
• 其原因是受精卵细胞质中的遗传物质都是来自卵细胞，即受精卵中的细胞质都是来自母方，父方不提供细胞质中的遗传物质，只提供细胞核中的遗传物质，雄配子对此性状不发生影响
• 第二节DNA的组成戊糖、碱基、磷酸核糖的几种构象(核糖呈折叠的五元环)碱基的酮式和烯醇式磷酸（phosphate）多核苷酸链3-5磷酸二酯键DNA的一级结构DNA分子中各脱氧核苷酸之间的连接方式（3´-5´磷酸二酯键）和排列顺序叫做DNA的一级结构，简称为碱基序列
• 级结构的走向的规定为5´→3´
• 不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息
• 主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的.主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键,而磷酸基团在生理条件下离解为负离子.磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平面的.第三节DNA的二级结构(双螺旋结构)学习要求:重点掌握一、双螺旋结构提出的前期重要工作1,DNA碱基组成的Chargaff规则腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T
• 鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数也相等，即G=C
• 嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T
• ,DNA纤维的X-光衍射图二、B-DNA双螺旋结构1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型
• DNA是由两条反向平行的多核苷酸链组成的，分子的主链位于螺旋的外侧，碱基则堆积于螺旋的内部，两条多核苷酸链通过碱基间的氢键相结合
• ，反向平行的多核苷酸链,磷酸核糖骨架位于外侧2、碱基配对:C-GA-T3、双螺旋结构核糖双螺旋模型参数直径20Å螺距为34Å（任一条链绕轴一周所升降的距离）每圈有10个核苷酸（碱基）两个碱基之间的垂直距离是3.4Å
• 螺旋转角是36度有大沟和小沟配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称4、大沟和小沟和结构参数大沟中碱基差异容易识别，往往是蛋白质因子结合特异DAN序列的位点四、DNA的双螺旋结构稳定因素氢键碱基堆集力，碱基处于疏水环境中磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和，离子键范德华力

第11页：生理盐条件

• 氢键(Hydrogenbond4~6kc/mol)磷酸酯键(phosphoesterbond80~90kc /mol)
• 2 mol /LNa+生理盐条件,消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力碱基堆积力(非特异性结合力)疏水作用力(Hydrophobicinteraction)不溶于水的非极性分子在水中相互联合,成串结合的趋势力.范德华力（Vandewaalsforce）(1kc/mol—
• 6kc/mol)×n五、DNA的双螺旋结构的意义该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础
• 该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石
• 第四节A-DNA，B-DNA，Z-DNA比较学习要求：掌握B-DNA资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋,Z构象等形式DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键多核苷酸链含有许多可转动的键
• 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键苷键的顺式和反式构象在溶液中，DNA一般为B型
• 但在水的活度降低时，就转变为A型
• 自然状态下，A-DNA可能存在于DNA-RNA的杂交分子，和双链RNA分子中
• 与B-DNA相比，Z-DNA更为细长
• 有证据表明，Z-DNA存在于天然DNA中，但量极微小，有些证据表明，Z-DNA的存在与基因表达的调控有关
• 种DNA双螺旋构象比较ZBA细长适中粗短外型左手右手右手螺旋方向
• 84nm
• 37nm
• 55nm螺旋直径

第12页：碱变性方法

• 碱变性方法在pH=ll.3时，全部氢键都被淘汰，DNA完全变成单链的变性DNA
• 在制备单链DNA时，优先采取这种方法
• 或者盐浓度低于0.01mo1／L
• 在这样低盐浓度时，由于磷酸基的静电斥力，可以配对的碱基无法相互靠近，碱基堆集作用也仍然保持在最低水平
• 熔解曲线与Tm值缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到0.1℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线Tm：熔解温度（meltingtemperature）DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示
• Tm的大小与DNA分子中（G+C）的百分含量成正相关，测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度
• 同时，溶液的离子强度和环境条件也会影响Tm值影响Tm值的因素在A, T, C,G随机分布的情况下，决定于GC含量GC%含量相同的情况下,碱基排列对Tm值具有明显影响.即嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响.氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用.盐浓度对Tm值的影响有变性剂存在时尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键,改变碱基对间的氢键,Tm值可降至40℃左右.极端pH条件的影响PH=12时酮基→PH=2时NH2→烯醇基NH2+(质子化)改变氢键的形成与结合力,使Tm值降低.二、DNA的复性renaturation复性：在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复
• 不完全变性的DNA的复性只是已分开部分的双股链间碱基的重新配对，它犹如拉链的扣合
• 完全变性的DNA，两条分开的互补链只有在正确位点上形成氢键才能导致全面复性
• 复性条件1，有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力，常用的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCI
• ，有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高．否则配对碱基之间的氢键又难以形成的
• 般使用比Tm低20℃-25℃的温度
• 复性机制复性并不是两条单链重新缠绕这样的简单过程
• 它首先从单链分子的无规则碰撞运动开始，这种碰撞过程是随机的，与DNA的浓度，溶液的温度和离子强度有关

第13页：复性动力学的研究方法

• DNA分子中,dNt的排列状况(随机排列,重复排列)复性动力学的研究方法Cot曲线DNA复性是一种双分子二级反应，单链消失的速度可用下面公式表示：dC/dt=kC02其中C为单链DNA的浓度，单位是每升的核苷酸摩尔数
• t是时间，单位为秒
• k是二级反应常数，单位是升／mol秒，k值取决于阳离子浓度、温度，片断大小和DNA分子序列的复杂性
• C0为单链DNA的总浓度
• 重排成C/C0=1/(1+kCot)
• 复性的分数C／C
• 是起始浓度和经过时间的乘积Cot的函数，这样的函数可以绘成下面的图，称为Cot曲线
• 各个不同的DNA的cot值是不同的，不仅与k值相关，而且DNA分子序列的复杂性影响k值
• DNA分子的序列的复杂性X值定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值，例如（ATATAT…），其X值为2，（ATGC）的X值为4，没有重复序列的含有10核苷酸对的DNA分子的X值为105
• X＝KCot1/2
• Cot1/2是与基因组的大小成正比的.在通常使用的标准状况下(0.18当量的阳离子，片断大小400个核苷酸)．K=5×105(升×核苷酸对／核苷酸mole×秒)，即在此条件下，X＝5×105Cot1/2(核苷酸对)
• 分子杂交不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究
• 基因芯片(GeneChip)基因芯片又称DNA芯片（DNAChip）或生物芯片(Biologicalchip),是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析
• 基因芯片的基本构造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的芯片技术的应用3.DNA序列测定建立在特定序列的DNA与特定长度的寡核苷酸集合的杂交的基础之上

第14页：故而在碱基对中会伸过中点突出到对方一侧

• 环的嘧啶,故而在碱基对中会伸过中点突出到对方一侧
• 这一情况不仅增加了碱基的堆积程度，也使碱基官能团间发生挤压，而这种挤压是随序列而变化的
• 第八节超螺旋DNA学习要求：重点掌握自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle)简称CCC分子
• 这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)
• 有些单链环形染色体(如φx174)或双链线形染色体(如噬茵体A)，在其生活周期的某一阶段，也必须将其染色体变为超螺旋形式
• 对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子，但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个噜噗(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式.超螺旋DNA是几乎一切DNA，无论是环型或线型DNA的共有的重要特征
• 超螺旋结构的方向性导致左手超螺旋以一根绳子做实验：原来的绳子的两股以右旋方向缠绕
• 在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变导致右手超螺旋在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变超螺旋状态的定量描述公式1：L=T+WL——连环数（linkingnumber），DNA双螺旋中一条链以右手螺旋与另一条链缠绕的次数
• T——DNA分子中的螺旋数（twistingnumber）W——超螺旋数或缠绕数（writhingnumber）公式2：λ=（L-L0）/L0λ——超螺旋度（degreeofsupercoiling）L0——松驰态DNA连环数超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式，主要是负超螺旋
• DNA的变化情况：DNA在水溶液中,构型偏B型状态DNA以10.5bp/helix为最稳定构型小于10.5bp/helix向正超螺旋发展(紧缩态)大于10.5bp/helix向负超螺旋发展(松弛态)天然的DNA都是负超螺旋但一些生命活动过程中存在正超螺旋EB对超螺旋结构的影响负Superhelix→OC,L,DNA→正SuperhelixDNA超螺旋结构形成的意义使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中
• 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要
• 如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录
• 拓朴异构酶除连环数（L）不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topoisomerase）只在连接数上有差别的同种DAN分子称为这种DNA的拓扑异构体.DNA拓扑异构酶（topoisomerase）通过改变DNA的L值而影响其拓扑结构
• 催化DNA由一种拓扑异构体转变成另一种拓扑异构体的酶lei拓朴异构酶可分I型和II型两类*拓扑异构酶I通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，即使L增加１，反应无需供给能量

第15页：可引入负超螺旋

• 少２，可引入负超螺旋
• 拓扑异构酶II亦称促旋酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量
• 拓扑异构酶的类别和特性原核拓扑异构酶I的作用机制结果：连接数增加一个增加一个负超原核拓扑异构酶II的作用机制作用于双链涉及双链的断裂和连接－－每次使DNA的连接数改变2旋转酶(gyrase)TopⅡ亚类之一第九节染色质的结构学习要求：重点掌握染色体原来是指真核细胞染色后存在于核内的着色物体
• 它只存在于分裂中的真核细胞内
• 在非分裂细胞内，它是无定形的，并弥漫于核内，只是在有丝分裂前才形成确定的形状
• 核小体（Polynucleosome）是DNA在细胞内存在的形态生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在
• DNA分子十分巨大，与蛋白质结合后被组装到有限的空间中
• 人类最小的染色体（Y）：DNA拉直约为1.4cm，在有丝分裂最致密状态下，这条染色体长度约为2μm，因此包装比可以大到7000
• 组蛋白（Histones）在染色质中，与DNA相结合的蛋白质为组蛋白
• 组蛋白是一类较小，带正电荷，富含精氨酸和赖氨酸的蛋白质
• 组蛋白是已知最为保守的蛋白质中的一种
• 组蛋白可以分为5种基本类型，分别称为H1，H2A，H2B，H3，H4
• Histoneoctamer(组蛋白八聚体)DNA中的一些不寻常结构(了解)DNA的有些序列会形成特定的结构,这些不寻常的结构不是完全独立于B-DNA之外的,有些以B-DNA为基础,有些由B-DNA转变而来
• 现已发现的DNA不寻常结构有：Z-DNA结构，单链臌泡，三链DNA，四链DNA等

第16页：限制性内切酶大致分为两大

• 限制性内切酶大致分为两大类类型II的限制-修饰系统由两种酶组成，限制酶仅使DNA降解，而DNA的修饰由另一种甲基化酶承担
• 类型I的这两种活力存在于同一酶分子中
• 这两类酶的产物，辅助因子等也都相同
• 狭义限制酶指类型II的限制酶限制性内切酶的命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序
• 例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型
• “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶
• EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus influensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboIBamHINotINGATCN
• AvaIIGG(A/T)CCGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyGCGGCCGC
• SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’２）富含ＧＣ３）对称性—双对称外侧，产生５’-端突起EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
• 末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸G-3’ACGTC-5’5’-CTGCA3’-G5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’HOG-5’3’-CTTAAP3’-CTTAAG-5’GGG-3’5’-CCC３）平齐末端5’-CCCGGG-3’SmaICCC-5’3’-GGG3’-GGGCCC-5’２限制酶的用途
• DNA重组
• 限制酶（物理）图谱绘制
• 突变分析（RFLP分析）
• 限制酶的部分酶切与完全酶切二、DNA的序列分析化学法（Maxam-Gilbert)测序原理化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序

第17页：一端为放射线标记的末端

• 端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列i.嘌呤（A和G）序列测定G反应：硫酸二甲酯处理DNA链时，G的7位和A的3位氮原子被甲基化，甲基化后的嘌呤环可被哌啶取代，从而导致链断裂
• 由于G比A更易甲基化（5倍），且mG比mA更不稳定，因而易发生链断裂
• 控制好反应温度与时间，只使G反应而A不反应，从而可测出G序列
• G+A反应：若用甲酯代替硫酸二甲酯，A与G均会发生反应
• 比较两反应系统电泳结果，就可知道A的序列
• ii.嘧啶（C和T）序列的测定T+C反应：用肼处理ss-DNA时，可使嘧啶开环，被哌啶取代后而导致磷酸二酯键断裂
• C反应：若反应在高盐浓度下进行，T与肼的反应受抑制，因而可测得C的序列
• 该法的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶
• 待测DNA链的检测用32p末端标记
• 该法测序对250bp的序列效果最佳
• 第三章基因与基因组第一节基因和基因组概述基因概念演变的过程其实就是分子生物学发展的过程
• 9年丹麦遗传学家约翰逊（Johnson）首次将孟德尔遗传因子称之为“基因”（gene）遗传学家Morgan在著名的《基因论》中：基因是孤立的排列在染色体上的实体，是具有特定功能、能独立发生突变和遗传交换的、“三位一体”的、最小的遗传单位
• 1年，Beadle和Tatum，“一个基因一个酶”的假说
• 7年，S.Benzer，顺反子学说打破了“三位一体”的基因概念，把基因具体化为DNA分子上的一段序列，它负责传递遗传信息，是决定一条多肽链完整的功能单位，但它又是可分的，它内部的核苷酸组成或排列可以独立发生突变或重组，而且基因与基因之间还有相互作用，排列的位置不同，会产生不同的效应

第18页：单倍体基因组中的全部

• 粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子
• 叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子
• C值（C-value）：单倍体基因组中的全部DNA量(bp)，基因组DNA的核苷酸数定义为大C值，将受中心法则限定，结构基因的核苷酸数定义为小c值
• C值是每种生物的一个特征，不同生物之间差别很大.低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物中变化很大C值矛盾/C值悖论：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象
• C值变化范围宽意味着在某些生物中有DNA是不编码的从人类基因组计划的研究结果看，人类每个基因组内最高估计也仅有3万到4万个基因，即人类基因组中c值仅占C值得10%
• 其余90%的核苷酸序列的功能至今还未能全部解码
• 噬菌体ΦX174，其基因组DNA的C值为5378bp，但其功能基因有11个，如按编码基因的最低核苷酸数2000bp估算，其c值也超过22000bp，ΦX174的C值远远小于c值果蝇基因组基因第二节病毒基因和基因组病毒在生物学上的分化程度，比细菌、植物、动物各类群的总和还要高
• 因此不同类型的病毒，其基因组具有很大的差异
• 从核酸的类型上看，构成病毒的遗传物有些是DNA，有些是RNA，从核酸的结构看有些是环型，有些是线型，有些是双链分子，有些是单链分子，单链病毒基因组可能是正链的也可能负链的
• 病毒的特点：（1）病毒粒子是由蛋白质和核酸构成，其中的核酸只为DNA或RNA中的一种
• 病毒粒子是由预先形成的组分装配而成，自身不进行“生长”或发生分裂
• 病毒自身不具备进行能量代谢和产生蛋白质合成所需核糖体的遗传信息，在能量代谢上绝对的依赖于宿主细胞一、病毒核酸的类型根据基因组核酸的类型，可以分为DNA病毒和RNA病毒
• DNA病毒的DNA分子多数为双链线型结构，也有单链DNA和双链环状DNA
• RNA病毒的RNA分子多数单链线状，也有双链RNA

第19页：丰富区保守序列

• GC丰富区保守序列：GGGCGG,TGACGT在病毒复制过程有重要作用腺病毒adenovirus6.双链环状DNA病毒乳头瘤病毒papillomavirus基因组：双链环状DNA，可分为早期区（E）、晚期区（L）、上游调节区（upstreamregulatoryregion,URR）调节转录与复制7.单链环状DNA病毒噬菌体phiX1748.开环部分双链DNA病毒乙型肝炎病毒（HBV二、病毒基因与基因组的特点（1）重叠基因的概念：指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列
• 重叠基因的发现：1978年，Sanger，FeirX174DNA全长：5386核苷酸编码的9种蛋白全长：2000个氨基酸
• X2000= 6000核苷酸根据密码子的起始位置，一个DNA顺序可能有3种阅读框例如，序列ATTCGATCGCAA（1）ATTCGATCGCAA（2）ATTCGATCGCAA（3）ATTCGATCGCAA但只有一种具有编码的作用，称为开放阅读框（openreadingframe，ORF）
• 开放阅读框：基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断
• 基因重叠的方式1大基因内包含小基因：如：B基因包含在A基因内，E基因完全包含在D基因内
• 前后两基因首尾重叠：2噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的
• 而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子，果蝇蛹上皮蛋白质基因位于另一个基因的内含子之中人I型神经纤维瘤(NF1)基因的第一个内含子中有三个编码蛋白质的基因，其转录方向与NF1的相反
• 线虫基因组中每个基因平均有5个内含子，有的内含子中包含tRNA基因，其转录方向不一定与包含它的基因的转录方向一致
• 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次
• 反转录病毒基因组有两个拷贝
• 病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元
• 它们可被一起转录成为含有多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA
• 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一份不被翻译
• 第三节原核生物基因与基因组一、原核生物核基因和核基因组的特点E.coli的遗传物质主要是染色体DNA，另外还有质粒DNA

第20页：不同种质粒大小差别较大

• 少数质粒DNA呈线状，不同种质粒大小差别较大，其大小通常在1-500kb范围内
• 质粒并不是细菌生长所必需的，但赋于细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性，细菌毒素的分泌以及复杂化合物的降解等，上述性状均由质粒上相应的基因编码
• 自主复制性（2）可扩增性（3）可转移性（4）不相容性质粒在分子生物学研究中因其以下几个方面的特点而常常作为载体：1、体积小，便于DNA的分离与操作
• 呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定
• 有不受核基因组控制的独立复制起始点
• 拷贝数多，使外源DNA可很快扩增
• 存在抗药性基因等选择性标记
• 第四节真核生物基因与基因组与原核生物比较，真核生物具有细胞分化、组织特化和个体发育等明显的差异
• 真核生物基因和基因组的特点（1）真核基因组比原核基因组大得多2）真核生物的主要的遗传物质DNA与组蛋白等构成染色体，被包裹在核膜内，核外还有与核基因组发生互作的线粒体基因组、叶绿体基因组等3真核基因组主要是二倍体，真核生物一个结构基因转录成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵子的结构
• 真核细胞中许多来源相同、结构相似、功能相关的基因往往成套组合成一个基因家族（genefamily）
• 非编码序列多于编码序列
• 原核生物编码蛋白质的基因序列绝大多数是连续的，而真核生物编码蛋白质的基因绝大多数是不连续的，是被一些称作内含子（intron）的序列隔开，为间隔基因
• 原核基因组中除了rDNA、tDNA基因有多个拷贝外，重复序列不多
• 高等动植物基因组中存在大量的重复序列

第21页：间隔基因的存在对生物有什么意义呢

• 间隔基因的存在对生物有什么意义呢
• ①有利于储存较多的信息，增加信息量
• 些断裂基因以不同的剪接方式可以产生两种以至多种mRNA，于是编码不同功能的多肽
• ②有利于变异和进化
• ③增加重组机率
• ④可能是基因调控装置
• 细胞器基因组叶绿体和线粒体是半自主的细胞器，虽然具有独立的遗传系统，其DNA可编码自身所需的蛋白质及tRNA和rRNA，但其自身的基因产物还不能完全满足功能上的需要，必须有核基因的产物的协同作用，核基因编码的蛋白质和酶合成后可输入叶绿体和线粒体中，但是这两种细胞器的膜不允许核酸分子通过，因此二者基因表达所需的RNA均由自身提供，同样细胞器内的mRNA不能透过细胞器进入细胞质中，所以必须含有自己的蛋白质合成系统
• 叶绿体基因组叶绿体基因组DNA（chloroplastgenomeDNA，cpDNA）一般较大，不同植物的叶绿体DNA分子大小各不相同
• 在叶绿体基因组上一般都含有两个反向重复序列（invertedrepeat，IR
• IRA和IRB，大小在10～70kb之间
• 不同植物cpDNA大小的差异主要是由于反向重复序列大小的不同而引起的
• 叶绿体的基因表达类似于原核生物，cpDNA与核DNA不同，不含有5-甲基胞嘧啶，而且不与组蛋白结合，类似于原核生物DNA，比如，具有相同或相关功能的基因组成操纵子结构，转录物为多顺反子的形式
• 线粒体基因组线粒体基因组DNA大小在真核生物中差别较大，动物界物种的线粒体基因组DNA大小大多在15kb左右，植物界物种线粒体基因组DNA大小变化很大，编码的蛋白质主要是与能量代谢相关的酶
• 哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子，几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成，有许多基因的序列是重叠的

第22页：真核生物重复序列

• 真核生物重复序列的类型真核生物基因组的复性曲线往往出现两个或3个明显不同的C0t1/2位置，说明这类基因组中包含着重复次数显然不同的几个成分
• 图中第一部分，即复性最慢的部分是单拷贝DNA序列，第二部分为少量重复或中度重复DNA序列，第三部分为高度重复DNA序列
• １，单拷贝序列uniquesequence重复数为一个到几个，大多数结构基因即编码各种蛋白质的基因存在于单一序列中．真核生物的结构基因是割裂基因，包括内含子和外显子．单拷贝基因的表达能力很高
• 当然也不是所有的单拷贝序列都是编码多肽链的结构基因，因为真核生物基因组中编码的序列不过只有百分之几
• ２，中度重复序列moderatelyrepetitivesequence中度重复（１００－１００００），多为串联重复拷贝．这些基因的产物往往机体需求量很大．如ｒＲＮＡ基因,组蛋白基因.Alu序列家族在人类基因组中有约50万个拷贝，占基因组5%～6%，平均每6kb的DNA出现一段约300bp的重复序列
• 般在每个重复单位的第170为核苷酸附近都有AGCT的序列，它是限制性核酸内切酶AluΙ的识别与切割位点，Alu序列家族也因此得名
• （限制性内切核酸酶）限制性内切酶（restriction endonuclease)，切断特定核酸序列中的磷酸二酯键
• 类型II的限制-修饰系统由两种酶组成，限制酶仅使DNA降解，而DNA的修饰由另一种甲基化酶承担
• 狭义限制酶指类型II的限制酶限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序
• 例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型
• “Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶
• 限制酶的特点
• 识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸２）富含ＧＣ３）对称性—双对称４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
• 末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸３）平齐末端限制酶的用途

第23页：带的前面或后面有一个次要

• 带的前面或后面有一个次要的DNA带相伴随，这些小的区带就像卫星一样围绕着DNA主带，故称卫星DNA
• 并非所有的高度重复序列都能形成卫星DNA
• 卫星DNA依照其重复单位的的大小分为卫星序列、小卫星序列（minisatellitesequence）、微卫星序列（microsatellitesequenc）
• 小卫星序列的重复单位一般在15bp的范围内，微卫星序列指重复单位仅在2～5bp，如（CA）n，（GT）n，（GAA）n，它遍布于基因组中，是重复序列中的主要组成部分之一，呈现共显性遗传
• 微卫星序列的拷贝数在个体间呈现高度变异，因而具有高度的多态性，已成为真核生物基因组绘制遗传图谱的重要分子标记五、基因家族（genefamily）真核生物基因组中有许多来源相同、结构相关、功能相似的基因，这样一组基因称之为基因家族（gene family）
• 基因家族的成员在染色体上的分布形式是不同的，基因家族的成员可分散在不同的染色体上，也可分布于一条染色体上，也可能紧密的集中在一起
• 基因簇（genecluster）基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，分布在某一条染色体的特殊区域
• 它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质
• 如组蛋白基因家族聚集在第7号染色体长臂3区内
• rDNA基因家族根据基因家族成员序列的相似程度分类：A.经典的基因家族，家族成员序列有高度的同源性，序列一致，拷贝数高，非转录间隔区短而一致
• B.基因家族各成员的编码产物保守（大段的高度保守氨基酸序列）
• 只是DNA序列的相似性低
• C基因家族各成员的编码产物之间只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列的相似性更低
• D超基因家族，各基因序列之间无同源性，但其基因产物的功能相似

第24页：结构基因组学

• 结构基因组学（structuralgenomics）基因定位基因组作图测定核苷酸序列1遗传图谱（geneticmap）采用遗传分析的方法将基因或其它DNA序列标定在染色体上构建连锁图
• 有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置
• 构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记
• 包括：形态标记、细胞学标记、生化标记、DNA分子标记最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的
• 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记
• 分子标记以DNA序列的多态性作为遗传标记优点：不受时间和环境的限制，遍布整个基因组，数量无限，不影响性状表达，自然存在的变异丰富，多态性好，共显性，能鉴别纯合体和杂合体限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）DNA序列能或不能被某一酶酶切，相当于一对等位基因的差异
• 如有两个DNA分子（一对染色体），一个具有某一种酶的酶切位点，而另一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多态性
• 可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上
• 人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因
• 植物遗传图谱的构建选择研究材料（亲本），建分离群体，传标记检测，标记间的连锁分析标记间的连锁分析利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型，根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离，计算机软件可以应用2物理图谱的构建用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱
• 遗传图谱的缺陷：分别率有限，人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体，测序要求每个标记的间隔小于100kb，实际是599kb物理图谱作图的方法
• 限制酶作图
• 依靠克隆的基因组作图
• 荧光原位杂交

第25页：本章内容目录（续）

• down）的测序策略二、功能基因组学利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和利用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从以基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究
• ①基因组序列中所包含的全部遗传信息是什么
• ②基因组作为一个整体如何行使功能
• 基因功能研究1、计算机预测基因功能依据仍然是同源性比较
• 同源基因拥有一个共同的祖先基因，它们之间有许多相似的序列
• 种间同源基因，种内同源基因2、实验确认基因功能基因克隆，基因敲除（knock-out），基因的超表达，反义RNA技术，RNAi，转座子插入突变
• 转录水平上进行的基因表达差异分析1、差异显示反转录PCR技术2、基因芯片技术3、表达序列标签4、基因表达的系列分析第四章DNA的复制和修复第一节DNA复制概貌DNA的半保留复制semi-conservationreplicationDNA的半不连续复制semi-discontinuousreplicationDNA的半保留复制DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子
• 这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样
• 由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制DNA复制过程的顺序性DNA复制从分子的称为原点（origin）的特定位点开始，然后向未复制部分逐步扩大
• DNA分子中正在进行复制的部位称为复制叉（replicationfork）DNA正在复制的部位在电镜下观察起来犹如一只眼睛，称为复制眼（replicationeye）复制单位真核生物DNA复制时有许多复制原点，使整个DNA分子可分为多个可同时复制的单位，DNA的这种能独立进行复制的单位称为复制子（replicon）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉第二节DNA的复制酶和相关蛋白DNA复制是一个非常复杂的酶学过程,它需要30种以上的酶和蛋白质,人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系,其中一部分酶和蛋白质结合在一起,协同动作,构成所谓复制体(replisome)
• 学习要求:重点掌握一、DNA的聚合反应和聚合酶1957年,Arthurkornberg首次发现DNA聚合酶I,后来又相继发现了DNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ
• DNA聚合酶Ⅱ的作用还不清楚,根据实验室工作,它在DNA复制过程中似乎没有什么作用,DNA聚合酶Ⅲ在E.coli中才是主要的聚合酶
• 以后,三种DNA聚合酶分别简写为PolI、PolⅡ、PolⅢ
• DNA聚合酶反应通式DNA聚合酶只能以四种核苷5'-三磷酸为前体,即dATP、dGTP、dCTP、dTTPPoly(核苷酸)-3'-OH+dNTP→Poly(核苷酸)n+1-3'-OH+2PiDNA聚合酶活性5‘→3’外切核酸酶活性,3'→5'外切核酸酶活性25

第26页：聚合酶只能使链按

• 已知的DNA聚合酶只能使链按5’－3’方向生长如果DNA的延伸方向是3’→5’在0.2MNacl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端,需要其他机制以解脱Pol I是多功能酶切刻平移(nicktranslation),缺口平移该技术由Kelly等于1970年创立
• 其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick）,缺口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除
• 其结果是在缺口平移（nicktr－anslation）
• 根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP）置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每分钟计数）/μg的32P标记DNA
• 用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求
• DNA快速末端标记Klenow片段,该酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性
• 利用Klenow片段可以填补由限制酶消解DNA所产生的3’凹陷末端
• 因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’末端
• 用Klenow片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP取决于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用EcorRI切割DNA所产生的末端用[α-32P]dNTP标记
• 随机引物延伸这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法
• 原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记
• 变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA
• 因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物（randomprimer）
• 这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备

第27页：序列上装配成复制体

• 原点oriC序列上装配成复制体
• 许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基因dnaAdnaBdnaCdnaEdnaGdnaQpolAgyrAgyrBLigRepSsbE.coli复制开始,分子量52KDa聚集于oric链延长，引发体的组分，六聚体，分子量300KDa，每细胞20个分子，具有螺旋酶活性复制起始和前体片段合成的起始
• 引发体组分,分子量25KDa，六个单体结合于六聚体pol的核心蛋白：具有聚合和校对功能，分子量132KDa，每细胞20个分子引发酶，合成前体片断的引物，单体，分子量60KDa，每细胞75个分子复制的保真度
• PolЩ的全酶亚基ε，分子量27KDa.多功能的PolΙ,链的延长
• 前体片断连接DNA旋转酶的α亚基，能引入负超螺旋，能消除正超螺旋DNA旋转酶的β亚基DNA连接酶，缝合切刻，连接前体片断，分子量75KDa,每细胞300个分子
• 螺旋酶，在复制叉处解开DNA双螺旋，需水解ATP,分子量66KDa,每细胞50个分子单链DNA结合蛋白，能防止链间或链内形成氢键，复制叉的前进，引发过程，链的延长都不能缺少
• i(dnaT)预引发体及引发体组分n′n″n预引发体及引发体组分
• ,DNA复制的起始复制原点与复制的起始,oriC与E.coliDNA复制的起始大肠杆菌型的oriC在结构上有如下特征:(1)共有245bp,(A+T)含量占56%
• 3个13bp的重复序列和4个9bp的重复序列.这些位点是DnaA与oriC的结合所不可缺少的
• 依赖于oriC的体外复制起始系统必须要有DnaA的存在,而且对利福平是敏感的
• 这就表明DnaA和RNA聚合酶是不可缺少的
• oriC的复制起始还需要DnaB,DnaC,DNA引发酶,DNA旋转酶,DNA聚合酶Ⅲ全酶以及HU蛋白,拓扑异构酶I,SSB蛋白,RNAaseH等辅助成分
• E.coliDNA的复制起始转录激活DnaA识别并结合复制起点，DnaB－DnaC六聚体与oriC形成预引发体DnaG加入形成引发体（oriC引发体），合成引物RNA引物合成后，DNApol组装到引发的RNA上，完成复制体的组装引发体的形成高度解链的模板与蛋白质的复合体促进DNA引发酶加人进来形成引发体,然后合成引物RNA
• DNA的合成这项任务由DNA聚合酶Ⅲ全酶担任,其中t亚基为聚合酶,ε-亚基为3‘→5’外切核酸酶,β亚基保证了全酶作用的进行性(processivity),而r-亚基和γ-复合体则保证了β亚基作用的发挥

第28页：专一性终止蛋白

• b、专一性终止蛋白:E.coli中由tusgene编码（terminusutilizationsubstance）通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用每次复制时只使用一个终止位点噬菌体￠×174复制在80年代中期之前,人们把注意力主要集中在若干单链DNA的E-coli噬菌体上
• 这些噬菌体复制的第一步就是单链环状DNA转变为双链环状DNA(RFⅡ),进而成为双链环状超螺旋DNA(RFI)
• 这些噬菌体在进行复制的过程中,大部或全部使用寄主的复制酶系和蛋白质
• 因而研究这些噬菌体DNA的复制对于了解E.coliDNA复制机制应该是十分有用的
• 研究得较多的有M13、G4、ф×174等噬菌体
• ф×174是环状单链DNA,有5386个碱基
• ф×174DNA的复制,主要可以分为三个阶段：
• （１）亲本单链DNA(+)链转变成共价闭合环状双链超螺旋DNA(RFI)
• （２）多拷贝RF I的合成
• （３）后代单链DNA(+)链的合成A蛋白（gpA）：Φx 174基因A的产物结合到RFⅠDNA的复制原点的结合位点（引发体的帮助）,诱导相邻的识别位点的熔解(负超螺旋、富含A/T),其核酸内切酶活力切割（＋）链的4305与4306碱基的酯键，并共价连接于5’端（A），另一端为自由的3’－OH（G）复制的忠实性DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:
• DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为710-6）
• DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）
• 起始时以RNA作为引物DNA聚合酶的校对功能起始时以RNA作为引物的作用DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢
• 这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施

第29页：第二间隔期

• 就进入S期(3)DNA复制期,合成期(S)(4)第二间隔期(G2),细胞随后进入有丝分裂二、多个复制原点multiplereplicon(多复制子)例
• 果蝇5000replicons平均40Kb（酵母）哺乳动物平均100Kb2、真核生物的DNA聚合酶α、β、δ、ε、γ五种γ线粒体ε核内δ核内β核内α核内位置复制合成,修复后随链合成前导链修复与引发酶结合合成功能YesYesYesNO3’－5’校正活性NO真核生物的复制起始受许可因子的控制举例：酵母的自主复制序列酵母DNA中存在专一性的复制原点，它们称为自主性复制序列（autonomousreplicationsequence,ARS)
• 酵母中约含400个ARS，每个复制子约36kb
• 真核生物pol线粒体复制线粒体DNA的复制称为D-环复制
• 线粒体DNA是双链环状分子，两股链因浮力密度不同而区分为轻链（L链）和重链（H链）
• 复制从重链的原点开始，这时新合成的H链即置换原来的链，这样所形成的结构称为取代环（displacementloop,D-loop)
• 当H链合成进行到约2/3时，L链合成原点暴露，引发L链合成，延伸方向与H链相反
• DNA端粒的复制端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短
• 这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变
• 初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短
• 对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否
• 这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识
• 逆转录病毒(Retroviruses)逆转录酶是1960年由美国威斯康星大学Temin等人首先发现的
• 他们研究鸟类的路斯氏肉瘤病毒时发现了一种依赖于RNA的DNA聚合酶,也就是人们发现的第一个逆转录酶

第30页：外界环境和生物体内部的因素都经常会导致

• 外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代
• 所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之所在
• 在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA对生命的重要性
• 另一方面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，这样生物才会有变异、有进化
• DNA损伤的来源1)碱基的脱落自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来
• 个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个：估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞)在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，约占细胞DNA中总嘌呤数的3%
• 碱基(核苷)的改变电离辐射和烷化剂烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对，而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G－C转变成A－T
• 碱基类似物人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等
• 由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成碱基的自身改变DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变)，这种变化就会使碱基配对间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化
• DNA复制中的错误以DNA为模板按碱基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件，但也不是完全不发生错误
• 碱基配对的错误频率约为10－1－10－2，在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10－5－10－6
• 校正后的错配率仍约在10－10左右
• 插入(insertion)和缺失(deletion)5）嘧啶碱基的二聚体化6链的断裂DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂
• 电离辐射也能引起DNA链断裂

第31页：损伤会最终导致

• 损伤会最终导致DNA分子结构的变化，这种DNA分子水平上的突变(mutation)是整体遗传突变的基础
• 归纳DNA损伤后分子最终的改变，有以下几种类型：1.点突变(pointmutation) :指DNA上单一碱基的变异
• 转换(transition)
• 嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)颠换(transversion)
• 嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤点突变的形式沉默突变（silentmutation）点突变仅改变基因的一个密码子,由于遗传密码具有简并性,故这一改变可能并不会引起氨基酸的改变,有时即使个别氨基酸发生改变,但两种氨基酸性质相近,不会影响产物的生物学活性,这种突变称为沉默突变.致死突变（lethalmutation）有些氨基酸的改变导致产物生物学功能的丧失,如果这种蛋白质处于中心代谢途径,这种突变就会致死.渗漏突变（leakymutation）某一氨基酸改变的结果是基因产物的功能基本上未有重大变化,改变的只是km值和最大速度等.
• 缺失(deletion)插入(insertion)使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变(frameshiftmutaion)
• 倒位或转位(transposition)指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处
• 双链断裂对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件
• 突变或诱变对生物可能产生4种后果①致死性
• ②丧失某些功能
• ③改变基因型(genotype)而不改变表现型(phenotype)
• ④发生了有利于物种生存的结果，使生物进化
• DNA修复DNA修复(DNArepairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能
• 但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存

第32页：核酸外切酶将有损伤

• ②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除
• ③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙
• ④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来
• 这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构
• 错配修复（mismatchrepair）DNA复制是一个高保真的过程，但其正确性毕竟不是绝对的，复制产物中仍会存在少数未被校出的错配碱基
• 错配碱基的修复会使复制的保真性提高102~103
• 错配修复是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此，修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链
• 这是通过DNA的甲基化实现的
• E.coliDNA的GATC序列中的A的N6都是甲基化的
• 这是Dam甲基化酶负责的
• 复制后的一个短暂时间内，新合成的链的GATC中的A未被甲基化，故子代DNA暂进是半甲基化的
• 这样，半甲基化DNA成为识别模板链和新合成链的基础
• 错配修复发生在GATC的邻近处，故这种修复也称为甲基指导的错配修复（methyl-directedmismatchrepair）E.coli错配修复需要Dam甲基化酶，MutH，MutL，MutS蛋白，DNA解螺旋酶II，SSB，DNA聚合酶，核酸外切酶和DNA连接酶
• 重组修复(recombinationalrepair)切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的

第33页：生物进化需要可遗传的变异不断产生

• 生物进化需要可遗传的变异不断产生,变化的根本原因是突变,但就每个个体而言发生突变的几率毕竟很低
• 涉及到的基因数目非常有限，如果只有突变而没有不同个体间的基因交流，则生物体难以迅速组装产生最能适应环境条件的基因组合
• 而且，通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性，从而为选择奠定物质基础
• 第一节同源重组Homologousrecombination同源重组指由两条同源区的DNA分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程
• 真核生物非姐妹染色单体之间的交换，姐妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合、噬菌体的重组都属于这一类型
• 其中，E.coli等细菌的同源重组又称为依赖RecA的重组
• 真核生物同源重组也称交换（crossingover），是指减数分裂（meiosis）过程中染色体间遗传物质的交换
• 其特征是发生在同源DNA序列之间
• 重组酶能以两个DNA分子中任何一对同源序列作底物进行交换
• 特征涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成存在重组热点需要重组酶单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号一、同源重组的分子模型
• 断裂-复合Breakageandreunion
• 异源双链在重组位点上，每个双链都有一个由两个亲本DNA分子中的一股单链共同组成的双链区域，这段区域称为异源双链DNA（heteroduplexDNA）
• 分支迁移两个双螺旋形成的交叉连接很容易以拉链式效应扩散，也就是链交换可沿着双链滑动，这个过程称为分支迁移（branchmigration）
• Holliday结构重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点称为Holliday结构

第34页：细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移

• 细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境
• 细菌的基因转移主要有4种机制：接合（conjugation）、转化（transformation）、转导（transduction）、细胞融合（cellfusion）
• 细菌的接合作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为接合作用
• 供体细胞为雄性，受体为雌性
• 通过接合而转移DNA的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码
• 能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子（fertilityfactor），简称性因子或F因子
• 致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5΄端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链
• 在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置
• F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf)菌株，若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+,F质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F΄因子，F΄因子携带的基因可在受体菌表达
• 遗传转化遗传转化（genetictransformation）是指细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状的改变现象
• 具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞（competentcell）
• 自然条件下感受态的形成需要10多种蛋白质参与，实验室常用高浓度的Ca2+处理使细菌形成感受态
• 细菌的转导转导（transduction）是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程
• 细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组

第35页：结构连接点

• RuvA识别Holliday结构连接点
• Ruv B是一种ATP酶，为分支迁移提供动力
• RuvC是专一识别Holliday结构连接点的核酸内切酶，它在体外切断连接点以拆分重组中间体
• 在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组
• a.RuvA四聚体的图解
• 个亚基形成的结构像四个花瓣的花
• b.RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点
• （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心，RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动
• （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认
• c.RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心
• d.假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型
• RecBCD和RecA的共同作用单链侵入Single-stranduptake链交换Single-strandassimilation重组修复在复制叉处重组水平的ＤＮＡ修复第二节位点特异性重组位点特异性重组（Site-specificrecombination）需要在特定的位点上发生断裂和重接，从而产生精确的ＤＮＡ重排
• 位点特异性重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同
• 它们的作用包括某些基因表达的调节、发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等

第36页：整合作用需要由大肠杆菌编码的整合宿主因子

• 并成一个环状分子．整合作用需要由大肠杆菌编码的整合宿主因子ＩＨＦ（integrationhostfactor）的共同作用．模型说明attP和attB部位进行了交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交
• λDNA交换点之间的距离为7bp，在位点专一性重组中，有关蛋白质结合在att部位的特定位点上
• 当INT和IHF蛋白结合在attP位点时形成的复合物称为整合体（intasome）
• 整合体就是捕获att B的中间体
• INT蛋白分子可能作为整合体的一部分结合到attB的核心位点上，说明attP和attB的最初识别不是直接取决于DNA的同源性，而是由INT蛋白识别两个att序列的能力来决定的，当需要链交换反应时，同源序列在此阶段才显得重要
• 切除反应（excision）当诱发原噬菌体生长时，整合作用发生逆转，这个过程称为切除（excise）
• 切除需要Xis蛋白，它抑制整合作用
• INT，XIS，IHF连在一起覆盖了全部attP，从而不利于进行整合反应
• 当噬菌体进入溶源状态时优先发生整合反应
• 而当噬菌体进入裂解周期时则切除反应占优势，通过控制INT和XIS的存量发生适当的反应
• 细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌（Salmonellatyphimurium）由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白
• 遗传分析表明，这种抗原相位的改变是由一段995bp的DNA，称为H片段（Hsegment）发生倒位所决定
• hix基因编码特异的重组酶，即倒位酶（invertase）Hin
• 该酶为相对分子质量22000亚基的二聚体，分别结合在两个hix位点上，并由反向刺激因子Fis（factorforinversionstimulation）促使DNA弯曲而将两个hix位点联结在一起，DNA片段经断裂和再连接而发生倒位

第37页：转座子的类型和结构特征所有

• 活，如果是重要的基因则可能导致细胞死亡
• 转座子的类型和结构特征所有的转座子都有两个结构特征：1两端有20-40bp的反向重复序列（invertedrepetitivesequence,IR)（２）具有编码转座酶（transposase)的基因,这种酶催化转座子插入新的位置
• 在原核生物中已发现两种类型的转座子：2复合转座子（compositetransposon）1插入序列（IS）插入序列是最简单的转座子，IS因子是一种较小的转座因子，长度为750～1550bp，只含有与转座有关的酶基因，不含抗药性等其他基因，其两端都具有15～25bp的反向重复序列（invertedrepeat，IR）
• 可以在不同的复制子间转移位置，以非正常重组的方式从一个位点插入到另一个位点，从而对该位点的基因的结构与表达产生多种遗传效应
• 每一类型都以IS加鉴定类型的编号来表示
• 但后来的类型编号只反映它们的分离历史，并不表示至今所分离的插入序列的总数IS因子本身不具有表型效应，只有当它转座到某一基因附近或插入某一基因内部后，引起该基因失活或产生极性效应时，才能判断其存在
• 所引起的效应与其插入的位置和方向有关
• 转座时，宿主靶部位双链被交错切开，经修复后插入序列两侧形成短的正向重复
• 靶序列通常是任意的，但交错切开的长度是固定的，一般为5～9bp
• 复合转座子（Tn）一些转座子除了除了有转座酶基因外，还携带药物抗性(或其他)标记
• 这些转座子以Tn和数码来命名
• 其中一类是由携带药物标记的中央区域和两侧的臂(arms)组成的复合因子(compositeelements)
• 有的转座子的重复顺序就是IS，复合转座子也和IS一样，能从一个位点转座到另一个位点
• 转座子的转座机制转座的机制转座作用的机制仍可分为三种不同类型：即复制型，非复制型，保守型.其中复制型转座需要两种酶，转座酶和解离酶复制转座作用引起了转座子的一个复制，它插入到一个接受位点

第38页：本章内容目录（续）

• 因为太大的频率会破坏宿主细胞，研究表明每一个转座子都有控制它自身调换频率的机制
• 通过反义RNA的翻译水平控制IS10R外侧边缘两个启动子,PIN弱启动子,控制IS10R的转录,POUT—强启动子,右向转录宿主DNA,INRNA和OUTRNA,有36bp的重叠稳定性：OUTRNA››INRNA,大量OUTRNA作为INRNA的反义RNA四、转座子的某些遗传学效应1）引起插入突变2）插入位置上出现新的基因3）造成插入位置上出现靶DNA的少数核苷酸对的重复4）转座后原来位置上保持原有的转座子5）引起染色体的畸变6）切除五、真核生物的转座因子（一）玉米的控制因子Ac-Ds系统是玉米转座因子系统之一
• Ac属于自主控制因子，或称激活因子
• Ds属于非自主因子，又称解离因子
• Ac能自主转座，并形成不稳定的基因突变，但不使染色体断裂
• 它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds控制结构基因的表达
• Ds由Ac因子中间序列的缺失而形成，从而失去转座酶功能
• 当Ac因子存在时，能活化Ds，使其在基因组内转座或插入结构基因之内，导致基因失活或改变结构基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组
• 果蝇的转座元件果蝇中存在着几个转座因子的家族
• P因子是黑腹果蝇的一种自主性转座因子，P因子能诱发果蝇杂种的不育
• 杂种不育只发生在P品系雄性与M品系雌性果蝇之间
• P品系果蝇染色体携带P因子，M品系不含P因子
• 当P雄性与M雌性果蝇杂交时，子代体细胞正常，生殖细胞则发育不全，因而无后代
• 第四节逆转录转座子转座过程中需要以RNA为中间体，经过逆转录过程再分散到基因组中，称为逆转录子（retroposon）

第39页：本章内容目录（续）

• 链的序列作为有义链,其方向和核苷酸序列都与这一区域转录出来的RNA序列相一致(只是T和U的区别而已)
• 若干基本概念以D. S.DNA中的一条单链作为转录的模板在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下按AU，CG配对的原则，合成RNA分子模板单链DNA的方向为3’→5’,而非模板单链DNA的方向与RNA链相同，均为5’→3’.(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向)第二节RNA的结构和种类RNA与DNA的差异RNADNA核糖脱氧核糖糖AGCUAGCT碱基含稀有碱基不含稀有碱基*RNA分子有三大类，即信使RNA(messengerRNA,mRNA)核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)转移RNA(transferRNA,tRNA)所有这些RNA都按DNA碱基序列合成，这三类RNA结构与功能均不一样
• mRNA的分子结构原核生物mRNA特征先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列真核生物mRNA特征：“帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+单顺反子+“尾巴”（PolyA）rRNA的分子结构特征：单链，与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能
• 原核生物由5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA组成真核生物由5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA组成
• tRNA的结构二级结构特征：单链,三叶草叶形,四臂四环.三级结构特征：在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型第三节RNA酶促合成的特点RNA合成的基本特征1.RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸(NTP)ATP、GTP、CTP和UTP2.RNA链的生长方向也是从5‘→3’3.转录必须以一条DNA链为模板,按照碱基互补的原则进行转录.A-U,C-G第四节原核生物RNA聚合酶一、RNA聚合酶的结构E.coliRNA聚合酶由五个亚基所组成,即α2ββ‘σ
• α、β、β’、σ四种亚基的分子量分别为36.5KDa、151KDa、155KDa、70KDa,整个酶分子的分子量为465KDa
• 有时还可以看到与RNA聚合酶相结合的一个很小的蛋白质，叫做ω亚基,其功能尚不清楚
• α、β、β'、σ分别是基因rpoA、rpoB、rpoC和rpoD的产物α2ββ‘σ这样的整个酶分子称为“全酶”(Holo-enzyme)

第40页：亚基解离后的其余部分

• 而σ亚基解离后的其余部分(α2ββ‘)称为核心酶(Coreenzyme)
• σ亚基的最主要的功能是识别启动子,特别是启动子上的R位点
• 细胞内哪条链被转录(即转录的方向),转录的起点的选择都与σ亚基有关
• 体外转录实验中,用全酶可得到与体内相同的结果
• 而用核心酶时,模板链和起始点的选择都有很大的随意性
• β亚基可能参与底物(包括前体核苷三磷酸以及已经形成的RNA链)的结合以及催化磷酸二酯键的形成
• 在E.coli细胞内,某些药物能有效地抑制基因转录,如利福霉素类药物和链霉溶菌素(streptolydigin)
• 前者能抑制RNA合成的起始,后者能抑制RNA链的延伸
• 实验也表明,这两种药物均作用于β亚基
• 同时还发现β亚基与RNA的前体核苷三磷酸具有很高的亲和力
• α亚基可能参与全酶和启动子的牢固结合
• 在大肠杆菌被T4噬菌体侵染时,α亚基上的一个精氨酸发生了ADP核糖基化的修饰,从而降低了RNA聚合酶(全酶)对于寄主启动子的亲和力,而同时提高了与T4基因启动子的亲和力
• 这一牢固结合需要DNA双螺旋的局部解链
• 当RNA聚合酶核心酶沿着模板移动进行RNA链的延伸时,需要不断地在前面解开双螺旋,在后面恢复双螺旋,这些作用可能与两个α亚基的功能有关

第41页：亚基发现其识别位点时

• 当σ亚基发现其识别位点时,全酶就与-35序列结合(初始结合),形成一个封闭的启动子复合物
• 整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合,然后-10序列及起始位点处发生局部解链,一般为12bp-17bp
• 这时的全酶和启动子的复合物称为开放性启动子复合物
• 转录起始加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP
• 所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶
• 链的延伸以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3´,5´-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)
• σ亚基脱落后，NusA因子就结合到核心酶上，NusA因子可能在延伸和终止中发挥作用
• RNA合成的终止转录终止信号有两种情况弱终止子：依赖ρ因子（终止因子，terminators）的终止
• 在转录终止点之前有一段回文序列
• 强终止子：不依赖ρ因子（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域
• 富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）
• 依赖ρ因子的终止：ρ因子可能结合正在合成中的RNA链的5’末端,利用水解NTP放出的能量从5'向3'方向移动
• 而RNA聚合酶在终止子处的较长时间的延宕给予ρ因子以追赶的机会
• 第六节真核生物RNA的合成1.真核RNA聚合酶真核生物有三种RNApolymeraseI,II,III

第42页：启动子位于不转录的间隔区

• 的频率
• 启动子位于不转录的间隔区
• RNA pol I需要两种转录因子RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别
• 在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤分子上的N6、鸟嘌呤分子上的N2、胞嘧啶分子上的N4都是氢键供体，而腺嘌呤分子上的N7、N3，胸腺嘧啶分子上的O4、O2，鸟嘌呤分子上的N7、O6、N3和胞嘧啶分子上的O2都是氢键受体
• 由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合
• 这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实
• 当保守区某些碱基的取代不影响DNA上氢键的方位和特性时，启动子原有的功能保持不变
• 当局部DNA构象或电荷密度改变影响了这些基团的相对方位时，启动子的功能就会受到影响
• RNApolII的启动子真核生物RNA聚合酶II的启动子是多部位结构
• 它们都是由多个短的序列（元件）所构成
• 这些元件都在起始位点的上游
• 不同启动子所用的元件的种类、数目以及这些元件所处的位置都不同
• RNApolII不能识别这些元件并与之结合，而是由多种转录因子分别识别并结合后，RNApolII才能结合上去启动转录
• RNApolII启动子主要有四个部位（1）帽子部位，即转录起始位点

第43页：止密码子之后不翻译

• 止密码子之后不翻译的3′端下游非编码区
• 编码区从起始密码子AUG开始经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子
• 对于第一个顺反子来说，一旦mRNA的5′端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控
• 我们把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA(monocistronicmRNA)，把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA(polycistronicmRNA)
• 真核mRNA前体的加工剪接（Splicing）去除内含子，连接外显子5’帽端结构的生成3’端多聚A（polyA）的附加由RNA末端腺苷酸转移酶催化RNA5′端加“G”的反应是由腺苷酸转移酶完成的，帽子结构可能使mRNA免遭核酸酶的破坏
• 而且，有帽子结构的mRNA更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成
• 除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3′端都有polyA序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个左右
• 加polyA时需要由内切酶切开mRNA3‘端的特定部位，然后由polyA合成酶催化多聚腺苷酸的反应
• PolyA是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性
• rRNA前体的加工rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列
• 加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与
• 甲基化修饰：修饰在碱基上
• 自我剪接：一种核酶的作用
• 原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA真核rRNA加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接

第44页：剪接过程不需任何酶类与能量的参与可见

• 剪接过程不需任何酶类与能量的参与可见L19确实是个真酶，它即是一个核酸酶，也是一个聚合酶
• 生物学意义
• 发展了具有催化功能的大分子种类2、分子进化理论的发展1）RNA是原始生命中最早具有催化功能2）（切割，连接）的酶活性物质
• RNA是原始生命中最早具有遗传4）信息载体功能的物质，可自我复制（2）蛋白质（酶）参与的剪接内含子主要在tRNA前体中发现
• RNAaseP：RNAaseP是一种内切核酸酶
• 所有的tRNA5‘末端都是由该酶产生的
• RNAaseD：为外切核酸酶,作用于tRNA末端多余的核苷酸,直到CCA序列为止
• RNAaseⅢ以及相关的酶：这些内切酶负责切开基因之间的间隔子序列
• mRNA前体剪接snRNP催化的剪接mRNA前体的内含子必须精确的剪接掉,如果多剪接或少剪接掉一个核苷酸,就使得密码子改变了,从而合成出一个完全不同的氨基酸序列
• 些遗传性疾病,就是由于异常剪接造成的
• 真核生物基因的初始转录产物（mRNA前体）不仅要进行5＇端的帽子结构和3＇端poly（A）尾巴的合成，还必须进行内含子的剪接后才能成为成熟的mRNA，从而运输到细胞质中进行翻译
• 对于剪接反应来说，最主要的问题是要保证剪接反应的准确性
• mRNA前体的剪接与三段保守序列密切相关，这些序列结构可能提供识别信号进行正确的剪接
• 这三段保守序列分别位于内含子的起点边界（5＇端剪接位点）、末端边界（3＇端剪接位点）和分支位点

第45页：家族中特异识别

• 被核酸酶RNaseⅢ家族中特异识别dsRNA的Dicer酶,以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21-23nt的由正反义链组成的双链小分子干扰RNA(siRNA)，且每条单链的3’端都带有2个突出的非配对碱基（多数是UU）
• siRNA又被称为引导RNA（guideRNA）,是识别靶RNA的标志
• siRNA的生成启动了RNAi反应
• 效应阶段：siRNA结合一个核酶复合物，形成所谓的RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducesilencingcomplex,RISC）
• 这个核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成
• 激活该复合物需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程，活化以后的RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA
• 另外，通过遗传分析方法发现，线虫中的RDE-1、MUT-7和DNA/RNA解旋酶及其他PAZ/Piwi蛋白也参与到该阶段的反应第七章蛋白质的生物合成中心法则指出，遗传信息的表达最终是合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质，这种以mRNA上所携带的遗传信息,到多肽链上所携带的遗传信息的传递，就好象以一种语言翻译成另一种语言时的情形相似，所以称以mRNA为模板的蛋白质合成过程为翻译(translation)
• 蛋白质生物合成体系包括1、mRNA与遗传密码2、tRNA与氨基酸3、rRNA与核糖体4、各种辅助因子第一节mRNA和遗传密码mRNA(messengerRNA)是蛋白质生物合成过程中直接指令氨基酸掺入的模板，是遗传信息的载体
• 遗传密码遗传密码:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码
• 密码子(codon)：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码
• 三联体密码的破译1954年Gamov确认核酸分子中三个碱基决定一个氨基酸1961年Crick等用遗传学方法也证实三联体密码子学说是正确的1964年Nirenberg以均聚物共聚物为模板指导多肽的合成,寻找到了破译遗传密码的途径Khorana以共聚物指导多肽的合成，加快了破译遗传密码的步伐缺失或插入核苷酸引起三联体密码的改变CATCATCATCATCATCATATCATCATCATCCACCATCATCATCATAXTCACCATCATCATCATATXTXCCAX45

第46页：合成产物为PolyCys-Val

• 以均聚物为模板指导多肽的合成PolyU为模板，产生的多肽链为PolyPhePolyC为模板，产生的多肽链为PolyProPolyA为模板，产生的多肽链为PolyLys以特定的共聚物为模板指导多肽的合成（1）以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽,如以PolyUG为模板，合成产物为PolyCys-Val
• 以多聚三核苷酸作为模板，可得三种氨基酸组成的多肽
• (AUC)n(UCA)nAUCAUCAUCAUCUCAUCAUCAUCA(Ile)n(Ser)n(2)遗传密码的性质1、密码是无标点符号的且相邻密码子互不重叠
• 移码突变(frameshiftmutation)碱基的插入和缺失常引起读码框的移动.重叠基因1976年,发现噬菌体ф×174环型单链DNA中一个DNA碱基顺序可以编码出两条不同的多肽链,有的基因完全埋藏在另一个基因中.Gene D读码框架UGC GUU UAUGGU ACGCUGGACGene E读码框架UGCGUUUAUGGUACGCUGG
• 密码的简并性和变偶性密码的简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并性（dogeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子(Synonymouscodon)
• 密码的简并性可以减少有害突变密码的摆动性（变偶性）：密码的专一性主要是由第一第二个碱基所决定，tRNA上的反密码子与mRNA密码子配对时，密码子的第一、二位碱基是严格的，第三位碱基可以有一定的变动
• Crick称这一为变偶性（wobble）.基结合带氨基酸的tRNA，tRNA的反密码蛋白质合成时，mRNA结合于核糖体小亚基上，大亚子与mRNA密码子配对1966年Crick根据立体化学原理提出:变偶假说1mRNA上的密码子的第一、第二个碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对
• 密码的专一性主要是由这两个碱基对的作用
• 有些反密码子的第一个碱基（按5-3，与密码子的第三个碱基配对）决定了该tRNA识别密码子的数目
• 当一种氨基酸有几个密码子时，只要他们的第一和第二个碱基中有一个不同，则需要不同的tRNA来识别
• 这样，便至少要有32种tRNA来与61个密码子相结合
• 密码子的使用频率密码子具有简并性，即同一种氨基酸具有多个密码子，但密码子的使用不是随机的
• 在E.coli中发现,有些密码子被反复使用,而有些则几乎不被使用
• 如E.coli核糖体蛋白质基因的1209个密码子中,编码苏氨酸的4个密码子中ACU使用36次,ACC26次,而ACA只3次,ACG完全没有

第47页：密码的通用性和改变遗传密码在从低

• 因此称为终止密码子（terminationcodon）
• 由两个终止或释放因子RF1和RF2来识别
• 密码的通用性和改变遗传密码在从低等到高等的各种生物中都是通用的
• 但在1979年，Barrell发现在线粒体中，AUA编码的是甲硫氨酸Met而不是异亮氨酸ILe，UGA不是终止密码子而编码色氨酸Trp
• 遗传密码的突变错义突变（missensemutation）：当一个密码子发生改变，使这个密码子编码出另一个氨基酸
• 错义突变产生的蛋白质只改变一个氨基酸，往往仍具有原来的一些生物活性
• 无义突变（nonsense mutation）：终止无义密码子改变成有义密码子，或有义密码子改变为无义密码子
• 无义突变会改变生成的多肽的长度
• mRNA所有的mRNA都是单链的多聚核苷酸，含有一个决定氨基酸序列的编码区，还有与起始密码子和终止密码子紧邻的侧翼序列
• 真核生物的mRNA与原核生物的mRNA有些区别
• 原核细胞mRNA的结构特点1、半衰期短2、许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在3、AUG作为起始密码
• AUG上游7～12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区，16SrRNA3’-端反向互补而使mRNA与核糖体结合
• 真核细胞mRNA的结构特点Poly(A)尾巴的功能1、是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式2、它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性帽子结构功能①使mRNA免遭核酸酶的破坏②使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质③被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成
• 第二节tRNA与氨基酸结合氨基酸：一种氨基酸有几种tRNA携带，结合需要ATP供能,氨基酸结合在tRNA3‘-CCA的位置

第48页：本章内容目录（续）

• 以通过编码校正tRNA基因的表达来完成
• 无意义和错义突变校正均可通过突变tRNA(或校正rRNA)介导
• 例如在色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)A基因突变(用Arg取代了正常的Gly，使TrpRS失活)时，可经过校正性突变使Gly插入突变的Arg部位，使酶复活
• 其校正子就是tRNA，提示突变已经改变了tRNAGly的反密码子
• 在E.coli中有三种同工(isoacceptor)tRNAGly，每个同工tRNA的反密码子不同
• tRNAGly只识别GGG，但密码子GGA也可被tRNAGly识别(由于tRNAGly反密码子的摆动性，使之可与GGG或GGA配对)
• 所以tRNAGly对于蛋白质合成不是必需的，当它的反密码子由CCC改变为CCU后，便可识别Arg的密码子AGG
• 因此，类似于tRNAGly这样的次要tRNA，在体内可能起校正作用
• 第三节rRNA与核糖体核糖体是由rRNA（ribosomalribonucleicacid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在核糖体上
• 上进行的
• 核糖体（ribosome)：1、有容纳mRNA的通道2、能结合起始、延长及终止因子等
• 有A位（acceptorsite)和P位(donorsite).4、有转肽酶活性，催化肽键形成5、大亚基上有延长因子依赖的GTP酶活性，可为转肽提供能量
• 第四节蛋白质合成的辅助因子起始因子（initiationfactor)延长因子(elongationfactor)终止因子(terminationfactor)真核和原核细胞参与翻译的蛋白质因子参与起始复合物的形成*阶段原核真核功能***IF1IF2IF3起始***eIF2eIF
• eIF4CCBPIeIF4ABFeIF5eIF6与mRNA帽子结合参与寻找第一个AUG协助eIF

第49页：第一步是氨基酸

• OH与氨基酸的羧基形成活化酯－氨基酰-tRNA
• 氨基酰-tRNA的形成是一个两步反应过程：第一步是氨基酸与ATP作用,形成氨基酰腺嘌呤核苷酸
• 第二步是氨基酰基转移到tRNA的3'-OH端上,形成氨基酰-tRNA
• 氨基酸活化的总反应式是：氨基酰-tRNA合成酶氨基酸+ATP+tRNA+H2O氨基酰-tRNA+AMP+PPi每一种氨基酸至少有一种对应的氨基酰-tRNA合成酶
• 它既催化氨基酸与ATP的作用,也催化氨基酰基转移到tRNA
• 氨酰-tRNA合成酶特点a、专一性：对氨基酸有极高的专一性，每种氨基酸都有专一的酶，只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸
• 对tRNA具有极高专一性
• b、校对作用：氨酰-tRNA合成酶的水解部位可以水解错误活化的氨基酸
• 多肽链合成的起始起始密码的识别首先辨认出mRNA链上的起始点（AUG），核糖体小亚基上的16SrRNA和mRNA的SD序列（位于起始位点上游4－13个核苷酸）结合N－甲酰甲硫氨酸－tRNA的活化形成起始复合物的形成起始因子的作用IF-
• 5kd加强IF-2，IF-3的酶活IF-295kd-117kd促使fMet-tRNAfmet选择性的结合在30S亚基上IF-320kd促使30S亚基结合于mRNA起始部位具有解离30S与50S亚基的活性三、肽链的延长进位（氨酰tRNA进入A位点）参与因子：延长因子EFTu（Tu）、EFTs（Ts）、GTP、氨酰tRNA肽链的形成肽酰基从P位点转移到A位点，形成新的肽链移位（translocase）在移位因子（移位酶）EF－G的作用下，核糖体沿mRNA（5’-3’）作相对移动，使原来在A位点的肽酰－tRNA回到P位点四、肽链合成的终止与释放识别mRNA的终止密码子，水解所合成肽链与tRNA间的酯键，释放肽链RF1识别UAA、UAGRF2识别UAA、UGARF3影响肽链的释放速度肽链合成的终止及释放
• 释放因子RF1或RF2进入核糖体A位
• 多肽链的释放（3）70S核糖体解离五、多核糖体在细胞内一条mRNA链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个
• 蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA的3’端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，现向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第

第50页：三个核糖体

• 个核糖体，依次下去，直至终止
• 每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率
• 原核生物蛋白质合成的抑制因素1、嘌呤霉素嘌呤霉素结构很类似氨酰-tRNA，故能与后者相竞争，进入A位点，当生长着的肽链被转移到嘌呤霉素的氨基上时，新生的肽酰-嘌呤霉素会从核糖体上脱落下来，从而终止翻译
• 肽链合成过早终止，而且截短的肽链的羧基端连有一分子的嘌呤霉素
• 链霉素链霉素能与30S亚基结合，从而形成效率很低的不稳定的起始复合物
• 四环素四环素能阻断氨酰-tRNA进入A位点
• 氯霉素抑制50S大亚基的肽酰转移酶的活性
• 红霉素抑制肽酰转移酶，妨碍移位
• 第六节真核生物蛋白质的生物合成1、细胞核内进行转录，加工再输入细胞质中进行蛋白质合成，转录、翻译不偶联
• 真核细胞核糖体比原核细胞核糖体更大更复杂
• 肽链合成的起始：由40S核糖体亚基首先识别mRNA的5’端-帽子，然后沿mRNA移动寻找AUG
• 起始氨基酸为Met，不是fMet
• 起始因子有十多种，但只有2种延长因子和1种终止因子
• 真核细胞种线粒体、叶绿体的核糖体大小、组成及蛋白质合成过程都类似于原核细胞

第51页：蛋白质合成过程小结肽链合成方向

• 蛋白质合成过程小结肽链合成方向N–C以mRNA的5’-3’方向阅读遗传密码该合成过程是一个耗能过程第七节蛋白质折叠与多肽链的修饰由mRNA翻译得到的多肽链是初级产物
• 由它们转变成相应的天然蛋白质，包括从末端或内部位置去除某些氨基酸残基，某些氨基酸侧链的改变，以及多肽链折叠成适当的二级与三级结构
• 蛋白质折叠肽链折叠是指从多肽链的氨基酸序列形成具有正确三维空间结构的蛋白质的过程
• 体内多肽链的折叠目前认为至少有两类蛋白质参与，称为助折叠蛋白:1、酶二硫键异构酶（PDI）在翻译产物形成的早期，半胱氨酸都是以还原的巯基形式存在，在PDI的催化下，新生肽键的巯基氧化成二硫键可以快速并正确的进行
• Cys-HS+Cys-HS——Cys-s-s-Cys2、分子伴侣Lasky于1978年首先提出分子伴侣（mulecularchaperone）的概念，这是一类在细胞内能帮助新生肽链正确折叠与装配组装成为成熟蛋白质，但其本身并不构成被介导的蛋白质组成部分的一类蛋白因子，在原核生物和真核生物中广泛存在
• 目前已鉴定很多分子伴侣蛋白质，其中被研究得最多的有两个蛋白质家族
• 胁迫-70家族有两个结构域，N端结构域保守，具有ATP酶活性
• C端结构域保守性较差，是与多肽链结合的部位
• 除参与蛋白质折叠外，在蛋白质的组装、跨膜、分泌与降解都有它们的参与
• 分子伴侣家族有两种氨基酸顺序相关的类型
• 大的叫分子伴侣-60，是个寡聚体，由14个相同亚基形成双层饼状
• 小的叫分子伴侣-10，由7个相同亚基组成单层环状
• 两种形成复合物，形状如空圆筒状
• 新生蛋白质就结合在圆筒上的开放空穴上，然后通过一系列ATP的水解，使结合蛋白进入中空的筒中，并使之折叠，折叠好被释放

第52页：蛋白质易位有二个主要途径

• RNA蛋白质易位有二个主要途径：一、共翻译易位在细胞质内合成的蛋白质是如何到达细胞的不同部位的呢
• 这首先要取决于蛋白质本身的结构,也就是它是否具有转运的信号
• 如果没有转运信号,它的命运就是留在细胞质里
• 而要到达细胞其他部位的蛋白质必须有转运的信号
• 定位于不同部位的蛋白质具有不同信号
• 细胞表面蛋白质、分泌蛋白质和溶酶体蛋白质(三者有时统称为分泌蛋白质)都具有信号肽
• 这些信号肽位于N端,长15个～30个氨基酸残基,大部分为疏水氨基酸,在最靠N端的几个氨基酸残基中,总是有带正电荷的赖氨酸或精氨酸
• 信号肽由信号肽识别颗粒(signalrecognitionparticle,简称SRP)所识别
• SRP能够与核糖体相结合并使肽链的延伸暂时受阻，SRP对翻译的阻断是暂时的,当它碰到粗面内质网膜上的72KDa的停泊蛋白〈dockingprotein)时,在内质网上打开通道，就不再阻止核糖体的翻译
• 这时,SRP离开核糖体而去识别新的信号序列
• 蛋白质共翻译转移入内质网腔二、翻译后易位线粒体、叶绿体、细胞核、过氧化物体中的蛋白质由核糖体合成，并作为前体按其所携带的信号不同而分别转运到不同的细胞器中去
• 这段信号被称为导肽
• 第八章原核细胞基因表达的调控第一节基因表达调控概述基因（gene）是指DNA分子中的最小功能单位
• 包括RNA(tRNAr、rRNA)和蛋白质编码的结构基因及无转录产物的调节基因

第53页：即使最简单的生物

• 事实上，即使最简单的生物，如病毒粒子基因组的表达，也是处于调控之中
• 几乎所有的基因都是被调控的
• E.coli细胞大约有4000个基因，约有107个蛋白质分子
• 如果每个基因都以相似的速度合成蛋白质，那么每个基因平均产生约3000个蛋白质分子
• 但实际上，细胞内各种蛋白质分子的拷贝数差异很大，有的蛋白质在细胞内只有几个分子，而有的蛋白质却多达50万个分子
• 细胞要使其蛋白质合成达到这种差异,可以有两条途径：第一条途径是细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度,这种控制通常称之为转录水平(transcriptionallevel)的调控
• 第二条途径是在mRNA合成后,控制从mRNA翻译成多肽链的速度,这种蛋白质合成或基因表达的控制称为翻译水平(translationallevel)的调控
• 转录水平(transcriptionallevel)的调控，是一种最经济的办法,可以免去浪费从mRNA合成蛋白质的各种元件和材料
• 这大概是生物在长期进化过程中自然选择的结果
• 大多数基因表达都属于转录水平的调控
• 翻译水平(translationallevel)的调控，包含一些分子装置问题,如与核糖体的结合速度等
• 这种调控是较少的
• 基因表达的多级调控基因表达调控的五个水平1、DNA水平调节2、转录水平调节3、转录后加工的调节4、翻译水平调节5、翻译后加工的调节一、基因表达的基本概念（一）结构基因和调控基因编码细胞结构和基本代谢活动所必要的RNA、蛋白质或酶，它们被称为结构基因（structuralgenes）
• 编码那些控制其他基因表达的RNA或蛋白质的基因，称为调控基因（regulatorygenes）

第54页：真核和原核生物基因表达的特点

• 真核和原核生物基因表达的特点（1）基因表达的时空性（2）原核生物的操纵子（3）真核生物的内含子（4）染色质（5）RNA聚合酶（5）转录调节第二节原核生物基因表达调控细菌的某一代谢途径中，几个酶按顺序起作用，在这种情况中，往往是这一系列的酶要么都产生，要么都不产生
• 这种现象叫协同调节，实际上这是由于编码上述所有基因产物的多顺反子mRNA的合成被调节的结果
• 有些酶活性通过生物合成途径中的产物或中间产物的浓度来共同调节，这个调节模式叫反馈抑制或终产物抑制
• 小的效应物分子也反复地用于激活或抑制一个特定的酶的活性
• 操纵子学说（一）操纵子学说的提出大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖
• 当培养基中有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长从大肠杆菌染色体的长度可以估计它大约可以编码2000-4000种蛋白质
• 般估计生长在以葡萄糖为唯一碳源的细菌中的酶类至少有600-800种
• 在这些酶中特别是与降解葡萄糖第一步有关的酶(即所谓关键酶),及与制造氨基酸与核苷酸有关的酶,以相当大的数量存在着,产生ATP所需的酶类也大量存在
• 在缺乏葡萄糖时,细菌也可以利用其它糖类如乳糖作为碳源,维持生活
• β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)是研究得最透彻的酶,它能将乳糖分解成葡萄糖及半乳糖
• β-半乳糖苷酶的分子量为460kD,具有四聚体结构,由4个分子量各为116kD相同的多肽链组成
• 这是一个极重要的酶,因为乳糖不能用做碳源或能源,它必须先被分解成简单的葡萄糖和半乳糖
• E.coli生长在乳糖中,则β半乳糖苷酶分子几乎有3000个之多,而生长在其它碳源的细胞此酶只有1/1000
• 这点说明当细胞需要一种蛋白质时,与它不需要的时候比较,它能以极大数量存在

第55页：聚合酶识别

• 启动子(promoter，P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列
• 操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5′侧上游，控制整个结构基因群的转录
• ．操纵子操纵子(operator，O)是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱
• ．调控基因（阻遏物）调控基因(regulatorygene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因
• 与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白(repressiveprotein)，其介导的调控方式称为负性调控(negativeregulation)
• 与操纵子结合后能增强或起动调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白(activatingprotein)，所介导的调控方式称为正性调控(positiveregulation)
• ．终止子终止子(terminator，T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
• 在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子
• 以上5种元件是每一个操纵子必定含有的
• 其中，启动子、操纵子和终止子都属于顺式作用元件(cisactingelement)
• 调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物棗调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用(transaction)
• 乳糖操纵子乳糖操纵子(lacoperon)是原核生物中研究得最清楚的一种操纵子
• 在乳糖操纵子上,除去β半乳糖苷酶(Z)和半乳糖苷透过酶(Y)基因之外,还有一个硫半乳糖苷转乙酰酶(thiogalactosidetransacytylase)基因(A)它的生理功能尚不清楚)
• 这3个基因每个前面都有一翻译信号,引导核糖体结合及蛋白质合成

第56页：担任这种转化的酶是腺苷酸环化酶

• 是需要的
• ATP是cAMP的直接代谢前体,担任这种转化的酶是腺苷酸环化酶(adenylcyclase),此酶可能受代谢降解物的直接抑制
• 环式AMP并不直接促进lacmRNA的合成,而靠结合在代谢降解物基因激活蛋白(catabolite-geneactivatorprotein),简称CAP上起作用
• 此后它就获得与DNA专一部位结合的能力,这时就增加邻近操纵子的转录速度
• CAP对一切葡萄糖敏感的操纵子都是正调控因子,
• CAP能控制RNA聚合酶在乳糖启动子上的结合
• CAP或者阻遏物对mRNA生长速度都没有任何影响
• 但二者则控制RNA聚合酶分子与启动子结合的速度,一个为正调控,另一为负调控
• 实际上阻遏物阻断RNA聚合酶的结合,CAP帮助RNA聚合酶有效地与乳糖启动子结合,使更多的RNA的合成起始进行
• 色氨酸操纵子色氨酸操纵子控制五种酶的合成TrpE，D，C，B，A
• 当色氨酸浓度低时,这5个邻近的trp基因才开始转录成mRNA
• 色氨酸不是一个诱导物,而是作为一个辅阻遏物(corepressor)
• 辅阻遏物活化其专一的阻遏物,因此它能与trp操纵基因结合并阻止其相应基因的转录
• 许多阻遏物分子能以活性的及无活性的两种形式存在,这要看它们与其适当的诱导物或辅阻遏物(corepressor)是否结合而定,诱导物的结合可使阻遏物失活

第57页：区组成的另一发夹

• 2区与3区互补,于是又形成一由2区及3区组成的另一发夹,从而阻止终止子发夹的形成
• 引导RNA编码14个氨基酸组成的短前导肽,其前面为一长的核糖体结合位点
• 前导肽有一特殊的序列特征:2个色氨酸密码子排成一列Met Lys AlaIle PheVal LueLysGlyTrpTrpArg ThrSer…这些密码子的功能是使企图翻译前导肽的核糖体停止前进
• 而当色氨酸缺乏时,核糖体达到色氨酸密码子时必须停止,围绕色氨酸密码子的RNA停下来结合在核糖体上,不能成为发夹环的一部分
• 在色氨酸密码子处被捕捉的核糖体被放在可使2区与3区自由配对的位置上,于是终止子发夹(3,4)不能形成,RNA聚合酶跨过弱化子达到操纵子,使trp酶表达
• 如果有充分的色氨酸,使核糖体得以通过色氨酸密码子前进,则核糖体阻止序列2,使3,4区形成终止子发夹,则转录在前导RNA末端停止
• 阻遏作用与弱化子控制之间可能同时存在,使得细胞内色氨酸微细调节到一个水平,使得两步反应更紧急地达到色氨酸饥饿,起始反应是停止阻遏物的结合,更大的饥饿则导致弱化作用的松弛,其它氨基酸的操纵子,如组氨酸及亮氨酸操纵子没有阻遏物,它们完全依靠弱化作用来控制
• 组氨酸MetThr ArgVal GlnPheLysHisHisHisHis HisHisHisProAsp…亮氨酸MetSerHisIleValArgPheThrGlyLeuLeuLeuLeuAsnAlaPheIleVal…这些前导肽的mRNA正是设计成能够察觉出所被合成的蛋白质的氨基酸水平
• 如果相应的氨基酰tRNA缺乏时,前导肽的翻译就自动停止下来
• 例如,在色氨酸操纵子中被阻止的核糖体促使mRNA的构象开放,使RNA聚合酶能阅读过弱化子部位
• 在组氨酸操纵子前导RNA存在7个编码组氨酸的密码子就强化了检查系统的灵敏性
• 这个组氨酸操纵子可以单纯靠弱化子的结构实现它的控制作用
• 基因表达翻译水平的调节（一）mRNA的结构对翻译的调控原核生物中基因的表达也在翻译水平上受到控制
• 蛋白质翻译的起始主要依靠AUG起始密码子上游富含嘌呤的6-8个核苷酸之存在与否

第58页：稀有密码子的调控作用在大肠杆菌基

• 种阻遏蛋白来起调控作用
• 稀有密码子的调控作用在大肠杆菌基因组上dnaG、rpoD（编码RNA聚合酶σ亚基）和rpsU（核糖体30S上的S21蛋白）同属一个操纵子，但三个基因的产物量却大不相同，dnaG仅50个拷贝/细胞，rpoD为2800拷贝/细胞，rpsU刚达40000拷贝/细胞之多
• 如何同一个操纵子中在翻译的过程中使它们的产物保持一定的比例
• 答案是利用稀有密码子，也就是说，这些密码子在其他基因中使用频率很低，而在dnaG中却很高，使dnaG的翻译十分缓慢
• 蛋白质翻译一旦开始后,其速度即受对应于mRNA分子中所利用的各种tRNA的供应情况而决定
• 在细胞中不同tRNA分子的数量是不同的
• 大量存在的那些tRNA通常是对应最常使用的密码子,因此,被稀少的tRNA分子所识别的密码子大都翻译得较慢,而被丰富的tRNA识别的密码子则翻译得要快些
• 魔斑核苷酸的调控作用大肠杆菌在氨基酸缺乏时不但蛋白质合成速度立即下降，而且RNA合成的速率也下降
• 后来发现大肠杆菌在氨基酸缺乏时能合成鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），这两种化合物是在层析谱上检出的斑点，所以被称为魔斑（magic spots）
• 缺乏氨基酸肽链延伸这一反应不进行了，GTP便可用作合成魔斑的前体，GTP→pppGpp→ppGpp，ppGpp也可以从ATP分子上转移2个磷酸分子到GDP的3′-羟基上形成
• 因此，pppGpp和ppGpp只在缺乏氨基酸的细胞中形成
• 旦ppGpp形成，它即抑制操纵子转录的起始，并使许多其他转录本的延长变得缓慢下来
• 第九章基因表达调控第一节真核基因表达调控真核染色体是由染色质(chromatin)构成的,染色质是由DNA和蛋白质形成的复合体
• 染色体是动态的物体，其外观随细胞周期的不同阶段发生明显的改变

第59页：真核基因表达

• 真核基因表达调控的多环节性根据基因表达调控的多层次性可以分为DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平等多层次的调控
• 然而真核生物和原核生物一样，转录水平的调控是最主要的调控
• 真核细胞在分化过程中会发生基因重排(generearrangement)和基因扩增(geneamplification)(2)真核基因的转录与染色质的结构变化相关真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录
• 如常染色质与异染色质与基因表达之间的关系，组蛋白对基因表达所起的作用以及活性染色质对Dnase的敏感性等，都与真核细胞的基因表达有关
• 真核基因表达以正性调控为主真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍
• 真核基因转录表达的调控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有两种作用者，但总的是以激活蛋白的作用为主
• 即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录
• 换言之：真核基因表达以正性调控为主导
• 染色质水平的调控真核细胞基因组DNA存在着以核小体为基本单位的染色质结构，这种结构特征产生了真核生物基因转录前染色质水平上的独特调控机制，典型的间期核染色质可分为高度密集状态的异染色质(heterochromatin)和较为松散的常染色质(euchromatin)，常染色质中的基因可以转录，异染色质中从未见有基因转录表达，原本在常染色质中表达的基因转如移到异染色质内也会停止表达
• 活性染色质的调控在染色体的不同部位上，由于染色质组成和分布上的差异，分为常染色质区和异染色质区，二者在结构上是连续的，这种差别被称为“异固缩现象”
• 在功能上，则可以区分为活性染色质和非活性染色质
• 只有在活性染色质中才能发生基因转录
• 在细胞核内的染色质一般有4种状态：（1）紧密压缩的状态
• 被阻遏的状态

第60页：组蛋白可

• 组蛋白可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用
• 染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用
• 活跃转录的染色质区段，有富含赖氨酸的组蛋白(H1组蛋白)水平降低，H2A·H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化(acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3组蛋白巯基化等现象，这些都是核小体不稳定或解体的因素或指征
• 转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构
• 这些都表明核小体结构影响基因转录
• 核小体核心组蛋白某些特定的氨基酸常可被共价修饰，其中最主要的是在N端Lys一残基氨基的乙酰化
• 组蛋白乙酰转移酶（histoneacety-transferases，HATs）可以活跃地与核心组蛋白发生相互作用
• 它的主要功能是对核心组蛋白分子N端25～40个氨基酸范围内的赖氨酸残基进行乙酰化修饰，使赖氨酸侧链不再带有正电荷，这样就失去了与DNA紧密结合的能力，使相邻核小体的聚合受阻，同时影响泛素与组蛋白H2A结合，导致蛋白质选择性降解
• 组蛋白H3和H4是蛋白酶修饰的主要位点，其乙酰化可能有类似促旋酶的活性，使核小体间的DNA因产生过多的负螺旋而易于从核小体脱落，致使对核酸酶的敏感性提高，有利于转录调控因子的结合
• 组蛋白的高乙酰化是活跃转录染色质的一个标志，即高乙酰化标志活跃转录而低乙酰化则与转录抑制有关
• 细胞核内的另一类酶复合体组蛋白脱乙酰酶，(histone-deacetylases，HDs)则起着与HATs相反的作用，对乙酰化的组蛋白进行脱乙酰化作用
• 已从不同的生物中分离鉴定出了相应的HD，它们通常也是一些多亚基的蛋白质复合体，与HAT一起，通过对核心组蛋白的乙酰化／脱乙酰化的动态修饰而调节转录的开启
• 组蛋白去乙酰化伴随着对转录的阻抑
• DNA水平的调控（1）DNA甲基化与去甲基化DNA甲基化同基因的活性调节时密切相关的，基因活化和结构基因本身及基因周围区域的甲基化水平之间有明显的相关性

第61页：甲基化模式在卵子发生时形成

• 甲基化模式在卵子发生时形成，因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式
• 目前发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称做印记中心(imprinting center, IC)
• 印记基因的存在反映了性别的竞争，从目前发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度，亲代通过印记基因来影响其下一代，使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势
• 基因丢失随着细胞分化将丢失染色体的某些DNA片段，造成基因的丢失
• 真核生物的生殖细胞保持了全部基因组，但早期体细胞要丢失部分DNA片段
• 在个体发育中基因丢失并不是普遍现象，在高等生物正常细胞中目前还没有发现基因丢失的现象，而只在少数低等的生物中发现
• 基因扩增基因扩增（amplification）即基因组中某些基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要
• 由于发育需要而产生的基因扩增现象，在原生动物、某些昆虫以及两栖动物中都有发现
• 氨甲蝶呤（methotrexate）是二氢叶酸还原酶（DHFR）的竞争性抑制剂，可阻断叶酸的代谢
• 当DHFR酶的基因发生突变，对氨甲喋呤产生抗性，或者在绝大多数细胞死亡的情况下，只有产生大量DHFR的极少数细胞能存活，这些幸存的细胞中DHFR基因达到上千个拷贝
• 这种内源性序列的扩增是由那些对一定药物敏感的细胞选择产生的，这种药物处理技术称为基因组序列的选择性扩增
• 在这种高抗性的细胞染色体中，可以观察到扩增区域形成一延伸的染色体带称均匀染色区（homogeneouslystainingregion,HSR）4基因重排基因重排是指某些基因片段改变原来存在的顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，再重排成为一个完整的转录单位
• 基因重排显示出生物的多样性，显示出基因组与mRNA复杂性之间没有线性关系
• 基因重拍最典型的例子是酵母的结合型转换和哺乳动物细胞免疫球蛋白基因的重排

第62页：启动子和增强子是由若干可以区分

• 启动子和增强子是由若干可以区分的DNA序列组成的，由于它们和特定的功能基因连锁在一起，因此称为顺式作用元件
• 包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)
• 近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子(silencer)
• 启动子启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列
• 不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子（trans-actingfactors）也不同，因此，基因转录活性也很不相同
• 增强子及其对转录的影响增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列
• 作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列性质：1、增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍
• 经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍
• 增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3kp，或在基因下游，均表现出增强效应
• 大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合
• 其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的
• 增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能
• 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应
• 许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应

第63页：接触的亚结构的结构基元仅有少数几

• 中与DNA接触的亚结构的结构基元仅有少数几个
• Helix-turn-helix（螺旋-转角-螺旋）是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角
• 其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA序列相识别的氨基酸
• Zincfinger（锌指）长约30个aa，其中4个氨基酸（Cys或2个Cys，两个His）与一个Zinc原子相结合
• 与Zinc结合后锌指结构较稳定
• 整个蛋白质分子可有20多个这样的锌指重复单位
• 每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸
• 螺旋--环--螺旋（helix-loop-helix）该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性α-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的
• Leucinezippers（亮氨酸拉链）是亲脂性（amphipathic）的α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体
• 每隔7个残基出现一个亮氨酸
• 由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成DNA结合区
• 有如日常使用的拉链结构,故称之为亮氨酸拉链
• 与已知DNA序列相结合的反式作用因子a.CAAT盒激活因子CTF（CAATboxtranscriptionfactor）家族是能识别CAAT盒的一组转录因子
• 这一组因子是由单个基因通过可变换的剪接而形成的一组mRNA产生的

第64页：亲和力却很不相同

• TFIID紧密相关
• GC区对SP1的结合是必需的，但该序列对于SP1亲和力却很不相同，证明GC区两翼序列同样在SP1的识别及结合过程中发挥作用
• 人们推测GC区、尤其是多次重复的GC区，与基因的永久型表达有关
• 真核基因表达以正性调控为主真核RNA聚合酶对启动子的亲和力很低，基本上不依靠自身来起始转录，需要依赖多种激活蛋白的协同作用
• 真核基因调控中虽然也发现有负性调控元件，但其存在并不普遍
• 即多数真核基因在没有调控蛋白作用时是不转录的，需要表达时就要有激活的蛋白质来促进转录
• 换言之：真核基因表达以正性调控为主导
• 真核生物的三种RNA聚合酶反应条件分子量(KDa)活性产物分布酶类低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度500～700～70050～70％20～40％10％rRNA（
• 8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNAsnRNA核仁核质核质ⅠⅡⅢ真核启动子（顺式作用元件）和转录因子（反式作用因子）真核的3种RNA聚合酶的启动子是不同的，但它们的共同特点是都含有特定的一套短的保守序列，每个序列都由特定的蛋白因子所识别并与之结合，然后这些蛋白因子与RNA聚合酶相互作用以形成起始复合体，由此复合体启动转录
• RNApolI的启动子和转录因子RNA pol I转录rRNA的基因
• 其启动子可分两部分：1）-40~+5称近启动子或核心启动子（corepromoter）
• 决定转录起始的精确位置
• 165~-40称为远启动子或上游调控元件（upstream control elements，UCE)，影响转录的频率
• 启动子位于不转录的间隔区

第65页：即转录起始位点

• 帽子部位，即转录起始位点
• TATAbox，基本上由AT碱基对所组成
• CAATbox，一般位于-75附近
• 增强子（enhancer），一般都在-100以上
• 对转录有增强效应，主要在于增强子与起始位点的距离效应
• 能协助RNA聚合酶II起作用的转录因子很多，可分为三类：1、基础因子(basalfactor)，启动RNA合成所必需的因子，也叫通用因子
• 与RNAPOLII结合成复合体，决定起始位点
• 上游因子(upstreamfactor)，识别并特异地结合在起始位点上游的元件上，活性不受调控，并且作用于任何具有其识别的元件的启动子，它们的作用是提高启动的效率
• 诱导型因子(induciblefactor)，其作用与上游因子相同，但它们是受到调控的
• 它们在特定的时间、条件或特定的组织中合成或被活化，因而有调控基因在不同时间、条件或不同地点表达的作用
• 因此把它们结合的元件叫应答元件(responseelement)
• 真核生物中，有些基因是在所有类型的细胞中都表达的，即这些基因的功能为所有细胞所必需，常把它们叫做持家基因(housekeepinggene)或组成型基因(constitutivegene)
• 而另一些基因则是公在某种类型的细胞中表达的，有时把它们叫做奢侈基因(luxurygene)
• 个仅含有被基础因子和上游因子所识别的元件的启动子能在任何种类的细胞中进行转录

第66页：酵母在缺乏这些营养的培养基上无法

• 同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长
• 当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落
• 将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作
• 诱导型因子和应答元件诱导型转录因子结合到一组具有相同应答元件的启动子或增强子上使之协同调控
• 金属硫蛋白保护细胞对抗过浓的重金属，其方式是与金属结合并将其从细胞中移去
• 在一般情况下基因以一个基本的水平进行表达，但在重金属离子或糖皮质激素的诱导下则以较高水平表达
• 基因表达调控的关键是要做到使基因在特定的时间、地点或条件下进行表达，即在需要表达时表达，不需要时不表达
• 这些被调控的基因的启动子或增强子中都有应答元件，当特异的诱导型转录因子结合在其上时，即能启动转录
• 因此，调控的关健是，当不需要它表达时，则灭活此因子
• 应答元件(responseelement)应答元件(responseelement)是位于基因上游能被转录因子识别和结合，从而调控基因专一性表达的DNA序列，如热激应答元件(heatshockresponseelement，HSE)、金属应答元件(metalresponseelement，MRE)、糖皮质激素应答元件(glucor-ticoidresponseelement，GRE)和血清应答元件(serumresponseelement，SRE)等
• 诱导型转录因子的几种活化方式(1)调控转录因子的合成(2)通过化学修饰改变转录因子的活性(3)由配体的结合活化或灭活转录因子(4)抑制因子的解除(5)二聚体的改变(7)mRNA前体的可变剪接真核编码蛋白质的基因经转录产生和初始转录物需经过加工后,才产生出成熟的mRNA,然后mRNA进入胞浆,经翻译产生出特定的蛋白质
• mRNA前体的这种加工包括加帽、加尾、剪接和编辑等
• mRNA前体的可变剪接大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种mRNA，因而只产生一种蛋白质，但有些基因产生的mRNA前体可按不同的方式剪接，即可变剪接（alternativesplicing），产生出两种或更多种mRNA果蝇性别的发育与性染色体和常染色体的比例相关XX/AA=1XY / AA=
• 5发育成雌性果蝇发育成雄性果蝇这种调控关系在胚胎发育早期就已确定，并保留记忆于体细胞中3个关键基因参与果蝇的性别决定sxl(性致死基因)tra(转化基因)dsx(两性基因)dsx-p→♂DSX-p→♀参与性别调控的细胞记忆形成依赖选择性剪接的级连调控8反式剪接（trans-splicing）通过剪接将一个RNA分子内部的内含子剪接掉，使外显子连接在一起，这种剪接方式称为顺式剪接（cis-splicing）后在锥虫、线虫以及植物的叶绿体中发现两个RNA分子之间的剪接，即反式剪接（trans-splicing）9RNA编辑（RNAediting）RNA编辑是个信息在mRNA水平上发生的改变的过程

第67页：内容主要涉

• editing内容主要涉及RNA中---CU,AItransitionmRNA稳定性的调控真核生物中mRNA的半衰期通常为8~10小时，然而有些真核mRNA的寿命却比较短，这类寿命比较短的mRNA的3`非翻译区都有个相似的序列，AUUUA，此序列是mRNA在细胞中不稳定的原因之一，缺失此序列可使原来不稳定的RNA变为稳定
• 有些mRNA的稳定性是受到调控的
• 如运铁蛋白受体(transferringreceptor,TFR)
• TfR合成的速度由细胞内铁的水平所调控
• 当细胞内铁的含量下降时，TfR合成增强，从而摄入更多的铁
• 而铁的含量多时则降低TfR的合成速度
• 已证明TfRmRNA稳定性的调控是调控TfR合成速度的重要环节
• TfRmRNA的稳定性受其3`端非翻译区的一段特异序列调控，此段序列可形成5个茎环结构
• 个叫做IRE-结合蛋白的蛋白质结合在此茎环上，使TfRmRNA稳定，不结合此蛋白质的TfRmRNA则易被降解
• RNA干扰（RNAinterference）几年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现
• RNA干扰（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在1998年的一篇Nature论文中被公诸于众
• RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)
• RNA干扰可以简单、有效、特异地下调细胞中基因的表达,它不但是研究基因功能的一种有力工具,而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段
• 现有的RNAi作用机制模型包括起始阶段和效应阶段:1）起始阶段：dsRNA进入细胞的方式可以是外源导入或者转基因、病毒感染等