页数：78页文件大小：5.67 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件讲解遗传重组：先概述重组的生物学意义与类型，继而说明同源重组的链交换与Holliday结构拆分及相关酶类，介绍λ噬菌体整合等位点专一性重组，最后讨论插入序列、复合转座子与真核转座成分的转座机制。
第九章遗传重组
概述第一节同源重组第二节位点专一性重组第三节细菌中的转座成分第四节真核生物中的转座成分
概述：◘只要有DNA，就会发生重组减数分裂高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座◘生存→变异→突变，重组损伤修复、适应环境、加速进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流◘遗传重组与重组DNA技术异常
第一节同源重组
同源重组（homologous recombination）:发生在同源DNA序列之间一、特征2、特征：◘涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大◘涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成◘存在重组热点◘需要重组酶◘单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号
细线期合线期粗线期双线期终变期◘e.g.Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组
双倍体染色体交换
同源重组的机制1、断裂复合及Holliday中间体的形成◘Holliday结构同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为…◘Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种◘同源重组都涉及到DNA分子内的－－断裂—复合
‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）置换侵入Loop切除同化异构化分支迁移5’切割
‘5‘（1）（2）其中－－所有模型和假说都包括切断、链置换、连接等过程双链侵入模型－－P143
双链断裂修复模型P145
分枝迁移和Holliday结构的拆分◘分枝迁移（branch migaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散
Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链heteroduplex DNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置
（2）（1）（2）◘Holliday结构的拆分产生含异源双链的亲本DNA分子产生重组体
“亲本链”“重组体”
原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、结合和转导1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点◘具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘RecBCD有固定切割位点
‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀chi位点：GCTGGTGG目前发现的重组热点E.coli含1000个、Euk.
e、RecBCD切割产生3’单链末端
RecA蛋白（1）活性a、RecA有单、双链DNA结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）
RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型
RecA promotes the assimilation of invading singlestrands into duplex DNA so long as one of thereacting strands has a free end.RecA启动的单链入侵
RecA引起的链交换和Holliday结构的生成
RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链为5’－3‘双链DNA的互补链是3’－5‘
RecBCD和RecA的共同作用
原核同源重组的其它蛋白需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase 10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体
E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点
第二节位点专一性重组
位点专一性重组（site-specific recombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：◘在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接----产生精确的DNA重排◘都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上Euk.中专一性抗体基因的构建
λphage的整合与切除1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachment siteatt）◘E.coli attB含BOB’三序列23bp◘λphageattP含POP’三序列240bp◘核心序列“O”完全一致（同源部分）---位点特异性重组发生的地方◘B,B’,P,P’---臂
整合过程◘整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）◘整合位点---attB、attP切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶（integrase Int）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用
溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体
整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距7bp◘整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合----核心序列的反向位点（切割位置）----结合在att臂上（臂与核心区靠近）
intIHFXis
整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB说明-----a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素
Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交
整合与切除的控制（1）整合◘CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的产生---与int gene的PI结合，转录产生Int蛋白---且PI位于xis基因内，CⅡ与PI结合导致xis gene失活（2）切除◘寄主SOS反应时---RecA大量产生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解---把OL和OR从阻遏状态释放出来---从PL转录使int和xis表达
依赖于同源重组的位点特异性的序列代换-----酵母MAT序列的转换1、酵母结合型的转变---DNA序列的代换，而不是互换---依赖于序列的同源性（被代换的序列命运是被降解调---突变试验）
同源序列匣子W X Y Z1 Z2 totalHML723 704747239 88 2501MAT723 704747239 88 2501MATa723 704642239 88 2369HMRa704642239 88 1585
转换过程◘内切酶(HO)识别、切割--Y/Z1交界处---起始MAT序列的转换(双链断裂)［HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护］①
Y区域被降解，直到Yα和Ya相同的部分或一直到X区域①②
四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对◘以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成③④
Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子
特征---同源重组和位点特异性重组特征都具有◘需要大范围的同源序列◘需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）
第三节细菌中的转座成分
A酶活性O gene Z基因终止突变位点离O基因的距离I p o Z YA
不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regional preference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）
Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simple transposon）（插入序列insertion sequence IS）复合转座子（composite transposon）◘共同特征：a）两端有20～40bp的IRb）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列◘最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp
特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）
IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应
Tn / TnA family 具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因 Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR)Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpRStrR)Tn5 (KanR) Tn6 (kanR)Tn7 (StrRTmpR) Tn9 (CamR)Tn10 (TetR)2.5 kb 20 kbTn3 IR TnpA Res TnpR AmpRIR38bp 38bp转座酶regulator β-内酰胺酶2、复合转座子◘两种类型
两端重复序列为IS的复合转座子e.g.IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISLIS R臂中心区臂transposition
当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）
转座噬菌体Mu phage（巨型转座子）Crepressor for A, BB33 kd与转座有关A70 kd转座酶U, S毒性蛋白attL, attR与寄主同源，反向重复，转座必需GinG区倒位酶att L C A B S U att R150bp 1.5kbG倒位区38kbPgin◘以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）
Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA（两侧各5bp的靶位点序列重复）b）进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装
转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式◘实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程扩增了转座子的拷贝（供、受点）◘需两种酶：转作酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）◘模式：
两大步a)共合体形成切口－连接－复制
拆分靶位点的DR形成
非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供体位点如不能被修复则有致死效应
保守型转座模式◘另一种非复制型◘与λ整合机制相似其转座酶与λ整合酶家族有关
TnA转座模式◘复制型转座转座酶(tnpA)、解离酶(tnpR)◘解离酶需要特异的内部位点双重功能：解离功能tnpA及自身的阻遏物◘拆分位点–res共合体拆分位点◘转座结果产生5bp的正向重复序列
转座子转座频率的调控◘每个转座子控制自身转座的核心----控制转座酶的水平不到一个转座酶分子／世代／细胞1、Tn10转座机制◘Tn10为复合型转座子◘IS10R元件提供转座酶活性-----合成转座酶的序列◘自发转座频率---10－7◘Tn10转座酶水平是控制转座的关键◘有两种控制转座的方式
通过反义RNA的翻译水平控制◘IS10R外侧边缘两个启动子◘PIN控制IS10R的转录弱启动子◘POUT—强启动子右向转录宿主DNA◘INRNA和OUTRNA有36bp的重叠稳定性：OUTRNA››INRNA◘大量OUTRNA作为INRNA的反义RNA
甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合◘Tn10转座酶启动子含有GATC序列（其它转座子）◘E.coli中Dam甲基化酶作用使启动子相对钝化只能利用刚刚复制完成时出现少数转座酶◘此外，IS10R的末端IR也含有GATC，甲基化的GATC不能结合转座酶◘Tn10在DNA刚刚复制后发生转座
转座子的某些遗传学效应－－P167
第四节真核生物的转座成分
真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：a)转座机制与细菌的转座子类似遗传信息：DNA→DNA◘玉米的Ac-Ds元件、果蝇的P元件和FB元件等b)转作机制类似逆转录病毒遗传信息：RNA→DNA→RNA◘如：逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的Ty元件
本章结束
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