页数：195页文件大小：7.13 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件系统讲解RNA的转录：从转录特征与RNA聚合酶入手，详细说明原核启动子结构、σ因子识别与转录起始，讨论内在终止与依赖ρ因子的终止机制，并介绍真核三种RNA聚合酶、转录因子与转录产物的加工剪接。
第六章RNA转录(RNA transcription)
基本概念6.2.原核生物RNA转录的起始6.3.真核生物RNA转录的起始6.4.转录的延伸6.5.转录的终止6.6.原核生物转录产物的后加工6.7.真核生物转录产物的后加工6.8.真核生物转录产物中内元的去除6.9.不连续转录和反式拼接
第一节基本概念
有义链(sense strand)[又称编码链codingstrand]:指不作模板的DNA单链 反义链(antisense strand)[又称模板链templatesrand] :指作为模板进行RNA转录的链(60年代以前的表示方法与此相反)
RNA的转录包括promotion. elongation. termination三过程从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单位(transcription unit) (转录起始点)原核生物的转录单位多为polycistron in operon,真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游记为正值upstream start point downstream－10＋1＋10
第二节原核生物RNA转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots)
两个相关概念:＊操纵元(operon):是原核生物基因表达调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子ipozyaNo lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresence of lactoseInactive
启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点(频率、效率)一、原核生物的RNA polymerase (E. coli)1、全酶(Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme)＋σββ’ααCore Enzymeβααβ’σHolo Enzyme
全酶（Holo Enzyme） 用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化) 专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014／mol 半衰期：数小时（107／mol 1秒以下） 转录效率低，速度缓慢（σ的结合）
核心酶（Core Enzyme） 作用于转录的延伸过程（终止） 依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间） 非专一性的结合（与DNA的序列无关） 结合常数：1011／mol 半衰期：60秒
不同的σ因子识别不同的启动子E.coli中有五种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28、σ24）枯草杆菌中有11种σ因子（σ因子的更替对转录起始的调控）（2）α因子 核心酶的组建因子 促使RNApol与DNA模板链结合α＋α2α＋βα2β＋β’ 前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链 尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链
β因子 促进RNApol＋NTP RNA elongation 完成NMP之间的磷酸酯键的连接 Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基） 与Rho（ρ）因子竞争RNA 3’－end
E site（elongation site. RifR）:对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）（4）β’因子 参与RNA非模板链（sense strand）的结合（充当SSB） 构成Holoenzyme后，β因子含有两个位点I site（initiation site . Rifs）:该位点专一性地结合ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）
由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点有义DNA链结合位点（β’亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）双链DNA解链位点（前端α亚基提供）单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）σ因子作用位点
E. coliRNA polymerase用于起始和延伸只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD
启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）1、启动子由两个部分组成（1）上游部分—CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白（2）下游部分—RNApol的进入（结合）位点－35~－10包括识别位点和结合位点（R B位点）
RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama框（Sextama Box）§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点，§RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点—识别位点（R位点）§大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol的σ因子）§位置在不同启动子中略有变动
Pribonow框（Pribonow Box）§-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点结合位点（B位点）§一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）§位置范围－4到－13因此又称TATA Box保守T
起始位点（initiation site）：＋1位点RNA聚合酶的转录起始位点起始NTP多为ATP或GTP
起始过程：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被σ因子发现并结合）
b、开放型启动子复合物的形成§RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡状物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合§开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向§两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）
～17bp
c.在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（β亚基）三元复合物形成+1位多为CAT模式,位于离开保守T 6~9个核苷酸处---6-9 bp---GC TATTGACATATAAT-----16-18 bp-------+1-35 sequence-10 sequence（4）σ因子解离→核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程
转录的起始过程σ核心酶12～17bp
（β亚基）
CAP-cAMP结合位点（也称CAP位点）转录调控中，I →阻遏蛋白→负调控lac操纵子模型
I
许多基因的表达还存在正调控机制例如: E.coli培养基中乳糖和葡萄糖共存时→只有葡萄糖被利用原因：CAP位点的正调控 葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将ATP → cAMP，cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能与RNApol结合 葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAP－cAMP与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结合RNApol
位点Ⅱ结合CAP－cAMP复合物后，促使RNApol进入Sextama Box,最终与－10序列结合起始转录原因：CAP－cAMP复合物与位点Ⅱ结合→SextamaBox富含G·C区域（G·C岛区）稳定性降低→Pribnow Box的溶解温度降低→促进开放型启动子复合物的形成→促进转录
RNApol在DNA上结合位点的鉴定DNase法----------40bp而足迹法（footprinting）结果相对准确足迹法原理： 限制酶切割结合有RNApol的DNA →大分子DNA 末端标记该DNA（Klenow片段标记3’,碱性磷酸酯酶标记5’） 用内切酶降解DNA（控制反应条件） 凝胶电泳分离，放射自显影观察
限制酶切分离大片段DNA
末端标记大分子DNA重新结合RNApol作对照直接用DNase进行降解电泳用微量DNase降解电泳
用足迹法鉴定出来的RNApol与DNA的结合区域为+20 ~－50（－40），大约60 ~ 70 bp 实验中还发现……………..5、启动子各位点与转录效率的关系（1）－35序列与－10序列与转录效率的关系标准启动子－35 TTGACA－10 TATAAT
则不同的启动子a.与标准启动子序列同源性越高→启动强度越大b.与标准启动子同源性越低→启动强度越小c.与标准启动子差异很大时→由另一种σ因子启动原因: －35序列通过被σ因子识别的容易→决定启动子强度 －10序列影响开放型启动子复合物形成的速度→决定启动子强度
－35序列与－10序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要 间距非常重要，17bp的间距转录效率最高 间距上的突变种类：间距趋向于17bp →上升突变间距远离17bp →下降突变 启动子上升突变、启动子下降突变
E.Coli各σ识别的启动子的序列δ28δ54δ24
第三节真核生物RNA转录的启动RNA Transcription promotion inEukaryots
真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApolⅠ最不敏感（动、植、昆）RNApolⅡ最敏感RNApolⅢ不同种类（物种）的敏感性不同2、位置和转录产物RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）
RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录hnRNA（mRNA前体，核不均一RNAheterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子RNA small nulearRNA)RNApolⅢ核质负责tRNA、5S rRNA、Alu序列和部分snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数RNApol（活性较低）
亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和7~12个(4-8)小亚基RNApolⅡ： 大亚基中有C末端结构域(carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）
CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化磷酸化的RNApolⅡ被称为ⅡA非磷酸化的RNApolⅡ称为ⅡB CTD参与转录→ⅡB→ⅡA→使RNApol易于离开启动子进入延伸过程（10倍）二、真核生物的启动子三种RNApol→三种转录方式三种启动子→三类基因，Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类
RNApolⅡ的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（cap site）：转录起始位点与Prok.的“CAT模式”相似（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框） 位于－30处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）
定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框） TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（CAAT box） 位于－75bp处 一致序列为GGC/TCAATCT 前两个G的作用十分重要(转录效率) 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性（距转录起始点的距离，正反方向）☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在
增强子（enhancer）（又称远上游序列far upstream sequence） 在－100以上 SV40的两个正向重复研究得最清楚（DR）-107~178、－179 ~－250各72bp 该增强子的特点如下：♪对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖的情况
♪距离效应:离72bp越近的容易起始转录♪极性效应：转录方向离开72bp的起始序列优先转录♪细胞类型的选择：不同类型中作用有差异表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（5）GC框（GC box） 位于－90附近，较常见的成分 核心序列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列
其他元件 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件）一致序列为ATTTGCAT KB元件一致序列为GGGACTTTCC ATF元件一致序列为GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件（7）不同元件的组合情况不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异例如：SV40的早期启动子中有6个GC框
小结： 不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始
RNApolⅢ启动子结构（1）分为三类，每种识别方式不同a、下游启动子（内部启动子）位于转录起始点的下游可分为两类5SRNA（1型）tRNA基因（2型）b、上游启动子snRNA
内部启动子的发现最早发现于非洲爪蟾的5S rRNA基因试验设置： 非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试验 以不同长度的5S rRNA基因为模板进行转录结果： 缺失＋55以前和缺失＋80以后的序列都能正常转录 缺失＋55到＋80序列不能转录
结论： 5S rRNA基因的启动子位于基因内部 该启动子可使RNApolⅢ在其上游的55bp处起始转录（3）内部启动子分为两类均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开第一类：含A框和C框（5S rRNA基因）第二类：含A框和B框（tRNA基因、腺病毒VARNA基因）间隔序列长短差异很大☻其中内部启动子起被RNApolⅢ识别的作用
种RNApol →三种转录方式三种启动子→Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类 RNApolⅠ核心启动子上游调控元件 RNApolⅡ帽子位点TATA框CAAT框 RNApolⅢ下游启动子（内部启动子） 第一类：含A框和C框（5S rRNA基因） 第二类：含A框和B框（tRNA基因)
真核生物转录的起始♫三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力♫转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定位于转录起始点
RNApolⅠTBP因子
RNApolⅢ的转录起始◎两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子TFⅢA一种含锌指结构的蛋白TFⅢB由TBP和BRT、B”TFⅢC至少5个亚基以上TFⅢB和TFⅢC是几类RNApolⅢ共同需要的转录因子
TBP因子TBP因子
☻TBP的作用三种RNApol的转录起始均需要TBP 所有RNApolⅢ的转录起始都需要TBP 在RNApolⅠ的转录起始过程中,TBP是SL1的组份，起定位RNApolⅠ的作用 RNApolⅡ的转录起始由TBP识别TATA框☻TBP起定位作用,所以又称定位因子（positioning factor）
RNApolymerasesare positionedat all promotersby a factor thatcontains TBP.TBP is a universalfactor
第四节转录延伸Transcription Elongation
起始到延伸的转变 始于第一个磷酸二酯键的形成 伴随着DNA分子和酶分子构象的变化1、Prok. 起始时，σ因子有利于β和β’亚基具有与DNA专一性结合所要求的构象 起始后,σ因子解离,β和β’亚基构象发生变化2、Euk. 多种辅助因子的共同作用来保证这一转变
延伸过程（Prok） 酶与产物RNA不解离 底物NTP不断加到RNA链的3’-OH端 形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动 延伸位点不断地接受新的NTP，RNA链不断延伸☻始终保持三元复合物的结构
转录泡 RNApol结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右DNA形成解链区 转录泡处杂交双链很短 胰脏RNAase______其长度10bp（不准确） 推测也就两个核苷酸左右
拓扑学问题ΦRNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变 RNApol的前沿…..解螺旋作用 RNApol后端…..DNA的螺旋化（保持…………）Φ超缠问题的解决靠DNA旋转酶ΦRNA-DNA杂交链也要求作旋转运动
旋转酶
转录过程中的延宕（1）RNA的合成速度大约30~50个核苷酸／秒,与蛋白质的合成速度相近（15个AA／sec）（2）模板DNA中G／C的存在延宕（G／C后的8~10个核苷酸）延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用思考:延宕发生的原因
第五节转录的终止Transcription termination
原核生物的终止子1、终止子的种类（1）内在终止子（不依赖ρ因子的终止子）体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止（2）依赖ρ因子的终止子蛋白质辅助因子－－ρ因子存在时，核心酶终止转录两者有共同的结构特征（序列差异）
不依赖ρ因子的终止子结构特征:☻一是形成一个发夹结构茎…. 7~20 bp的IR序列形成（富含G/C）环….中间不重复序列形成发夹结构的突变可阻止转录的终止☻二是6 ~ 8个连续的U串（发夹结构末端）
不依赖ρ终止子结构IRIR茎部富含GC
依赖ρ因子的终止子（1）结构IR序列中的G／C对含量较少发夹结构末端没有固定特征（2）靠与ρ的共同作用而实现终止
无连续U串G/C含量较少
原核生物转录的终止1、不依赖ρ因子的终止子终止转录（1）新生RNA链发夹结构形成与RNApol发生作用造成高度延宕（典型的有60秒左右）（2）RNApol暂停为终止提供了机会，6~8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号RNA－DNA之间的rU－dA结合力较弱阻止RNA链的释放
于是：RNA－DNA解离三元复合体解体RNApol解离转录终止（3）真正的终止点不固定，在U串中的任何一处（4）IR序列和U串同等重要IR中的G／C对含量的减少U串的缩短或缺失（5）DNA上与U串对应的为富含A／T的区域说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用
依赖ρ因子的终止子终止转录（1）通读（read through）：在依赖ρ因子的转录终止过程中，RNApol转录了IR序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有ρ因子存在，则RNApol会继续转录（2）ρ因子a、活性形式为六聚体促进转录终止的活性，NTPase活性
b、RNA长度大于50nt时，依赖RNA的NTPase活性最大说明：ρ因子识别和结合的是RNA（3）ρ因子对终止子的作用a、ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’端）b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动（NTP水解供能）（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会）c、ρ因子与RNApol相互作用而造成转录的终止
ρ结合上来追赶RNApolρ追赶上来（暂停）ρ与RNApol相互作用使杂交链解链终止子
终止反应还需要RNA与DNA的相互作用即：需要一定的RNA序列因为：其与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合ρ因子与RNApol的作用（发夹结构下游的AU序列）序列不同的终止子→→不同的终止程度→→基因表达调控的途径之一
RNApol核糖体ρ因子无义突变位点
终止与抗终止及抗终止因子♦各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段的基因表达*枯草杆菌------更替σ因子*T7噬菌体------更换RNApol*λ噬菌体采用依赖于ρ因子的终止以及通过抗终止因子的抗终止作用
λPhage的4个操纵元阻遏蛋白操纵元启动子PM左向早期操作元PL右向早期操作元PR晚期操作元PR’
λPhage的操纵元组织情况PMPLPRPR’重组复制裂解溶原周期溶菌周期
PNPQ抗终止作用的过程极早期迟早期晚期
抗终止的机制 依赖于噬菌体本身的依赖ρ因子的终止子 依赖ρ因子的终止子上游有抗终止信号(靠近PL的nutL，靠近tR1的nutR nut—PN utilization) 抗终止蛋白和nut位点的结合，等待RNApol经过时修饰RNApol的构象，拮抗寄主编码的终止蛋白ρ的活性,使之通过那些依赖ρ的终止子
真核生物的终止子及转录终止了解很少（3’末端）1、RNApolⅡ的终止子类似Prok.不依赖ρ因子终止子，终止可能靠RNApolⅡ本身完成 SV40的终止子:发夹结构U串2、RNApolⅢ的终止子类似原核生物（发夹结构U串） U串位于发夹结构的顶端 且保守性很强（酵母→人） 环和柄对转录的终止同等重要
第六节原核生物转录产物的后加工Pre-RNA processing in Prokaryotes
ΦProk.的mRNA半衰期只有几分钟（基因表达调控的一种手段）ΦrRNA、tRNA比较稳定半衰期几小时成熟分子和转录产物的差别： 5’单磷酸／三磷酸 分子大小 异常碱基
rRNA后加工1、基因排列方式 三种rRNA基因（5S、16S、23S）与tRNA的基因形成操纵元（rrn）（E.coli七个） 每个rrn中tRNA基因无固定模式（种类、数量、位置）
个rRNA基因的相对位置有一定规律…16S rDNA……间隔tDNA…….23SrDNA…….5S rDNA……收尾tDNA…加工过程主要是RNAseⅢ等酶的作用
双链区域
tRNA的转录后加工1、tRNA基因（1）转录单元大多是多基因的同一个tRNA基因、不同tRNA基因、与rRNA基因（2）有两种类型的tRNA基因：Ⅰ型具有3’端的CCA序列Ⅱ型没有3’端的CCA序列
Ⅰ型需在酶的作用下切除CCA下游一段序列（Prok.的tRNA多为Ⅰ型）Ⅱ型需要在酶的作用下添加CCA序列（少数Phage、Euk.）
参与tRNA后加工的酶（1）RNAaseP：内切核酸酶，核蛋白使tRNA产生成熟的5’端识别tRNA的空间构象（2）RNAaseD：外切核酸酶，使Ⅰ型tRNA暴露出CCA端a、RNAaseP存在时RNAaseD可达最大活性b、RNAaseQ、RNAaseY、RNAaseP3与此酶功能相同
tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）以ATP和CTP为前体，催化tRNA（Ⅱ型）的3’端生成CCAa、E.coli中该酶基因突变后，会影响菌株生长（CCA末端常丢失）b、识别tRNA的空间结构，无种属特异性（4）RNAaseⅢ：与RNAaseO、RNAaseP2的功能相似，负责切开间隔序列
E.coli的tRNATyr1分子的修饰过程编码基因的原始转录物三磷酸有两个基因拷贝间隔子（各长350base）
有一个tRNATyr1的转录单元的原始转录物的修饰过程①②③④⑤⑤⑤⑤
RNA中的甲基化及常见的修饰核苷酸m5Cm6AHNHHNHOOHNHHN—CH3H3C Prok.中主要是碱基的修饰Euk.－－核糖、碱基
常见tRNA中的修饰核苷酸Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U（5-甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U（5-甲基-2硫代尿苷）K2C（2-赖氨酸胞苷）Com5U（5(2)-羟羧甲基尿苷）I（Inosine次黄嘌呤）m7G (7-甲基尿苷)m5C（5-甲基胞苷）m6A（6-甲基腺苷）s2C（2-硫代胞苷）ψ (假尿苷）Um (2’-O-甲基尿苷)Q（Queuosine）Xo5U (5-羟基尿苷)OHOHNHCH2H2NR
第七节Euk转录产物的后加工Pre-RNA processing in Eukaryotes
rRNA的转录后加工主体rRNA基因（5.8S、18S、28SrDNA）组成一个转录单元47S前体45S前体a、甲基化位点可能是酶识别的标志b、加工的对象是一种核蛋白c、哺乳动物的45SRNA前体有几种不同的加工方式
者的共同之处: 先切除18S rRNA之前5’端序列 18S rRNA部分与后面的5.8S rRNA和28S rRNA部分分开 5.8S rRNA和28S rRNA通过碱基配对相结合☀Euk.的5S rRNA也是和tRNA转录在一起，经加工处理后成为成熟的5S rRNA
mRNA的转录后修饰－--------帽子1、帽子的种类帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp----------（共有）m7G N7—甲基鸟苷帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp----------第一个核苷酸的2’-O位上产生甲基化（A N6位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp第二个核苷酸的2’-O位上产生甲基化（A、G、C、U）
HN—CH3m7G帽子0
其中: 单细胞真核生物只有Cap—0 Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式 Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子结构的生成 甲基供体都为S—腺苷甲硫氨酸（SAM） RNA鸟苷酸基转移酶-----戴帽酶（capping enzyme）
帽子结构的功能（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号Cap—0的全部都是识别的重要信号Cap—1,2的甲基化能增进识别（2）增加mRNA的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（Cap—1、Cap—2）除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式
mRNA的转录后修饰二--------多聚（A）尾巴1、3’端-----约长200bp (大多数Euk.的mRNA)（poly(A)+poly(A)-）最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3’添加poly(A)的现象E.coli的poly(A)+聚合酶早在1962年就已发现2、poly(A)的生成a、RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A)聚合酶）催化前体－－ATP
反应如下：多聚核糖核酸+ nATPMg++或Mn++多聚核糖核酸(A)n + nPPib、添加位点内切酶(360KDa)切除一段序列由poly(A)聚合酶催化添加poly(A)内切酶的识别位点（有其它因子参与）切点上游13－20bp处的AAUAAA切点下游的GUGUGUG（单细胞Euk.除外）
poly(A)的功能c、对含poly(A)的mRNA失去poly(A)可减弱其翻译（1）可能与核质转运有关（2）与mRNA的寿命有关（3）与翻译有关a、缺失可抑制体外翻译的起始b、胚胎发育中，poly(A)对其mRNA的翻译有影响（非poly(A)化的为储藏形式）
poly(A)在分子生物学实验中有很大应用价值a、可将oligo (dT)与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNAb、用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成cDNA
第八节Euk.转录产物中内元的去除Intron removing in Eukaryote
概述1、概念割裂基因（split gene）：指编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔开内元（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的DNA序列外元（excon）：
RNA拼接（RNA splicing）：一个基因的外元和内元共同转录在一条转录产物中，将内元去除而把外元连接起来形成成熟RNA分子的过程拼接点：5’拼接点或左拼接点（内元上游）3’拼接点或右拼接点（……下游）
内元的分类1982 Davies等人中部核心结构（central core structure）:在有些内元中，含有4个重复的保守序列，长度为10 ~ 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类
Ⅰ类内元（groupⅠ）:含有中部核心结构的细胞器基因核基因 Ⅱ类内元（groupⅡ）:不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内核基因 Ⅲ类内元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的边界序列核基因mRNA前体 tRNA基因的内元均位于tRNA的反密码环上
种内元的边界序列各有一定共同的特征
拼接方式方式一：由拼接装置完成（核mRNA内元）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二：自我拼接（两类内元Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应
tRNA的拼接（酵母为例）1、链的断裂和连接是两个独立的过程2、tRNA的内元均位于反密码环的3’端，与反密码子相距一个Nt（40不连续基因／酵母400核tRNA）长14~16bp，其中含一段与反密码环互补的序列反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象3、拼接酶系识别的是二级结构
酵母tRNAphe
拼接过程研究方法构建温度敏感突变体（高温时……………..）分离累积tRNA前体体外加入野生型细胞抽提液研究拼接过程
第一步：内切酶作用释放一条线状内元分子和两个“tRNA半分子”两个tRNA半分子采取成熟tRNA分子的构象(切刻)拼接过程
第二步：RNA连接酶连接断端其中内切酶作用后产生5’OH和3’磷酸，3’磷酸端很快转变为2’，3’环式核苷酸因此，一个半分子有两个磷酸末端，一个半分子有两个－OH末端
连接反应前要进行两个反应：a、左外元的3’端成为OH（环式磷酸二酯酶）其3’位为OH，2’位为磷酸b、第二个外元的5’端转变为磷酸基（多聚核苷酸激酶）因此Φ连接后还要切除第一个外元的2’—磷酸这是tRNA内元拼接重要特点之一
前体RNA两个半分子进行两个连接反应成熟tRNA
第Ⅰ类内元的拼接特点：ø拼接属于自我拼接ø形成明显的二级结构1、结构特点：（1）5’拼接点和3’拼接点-------U↓… …G↓↓ ↓5’……exon……U……intron……G……exon……3’
有由保守序列形成的二级结构a、保守序列为5’－P－Q－R－S－3’距拼接点很远，各10~12bpP与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构
b、二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成的二级结构内部引导序列（interal guide sequence IGS）：内元中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列#第一类内元的拼接依赖于以上二级结构－－为自我拼接的进行提供活性位点
拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA有内元5’ U G 3’小rRNA大rRNA（26S有内元）（2）35SRNA体外有自我拼接的能力反应需要：一价和二价离子鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和鸟嘌呤核苷）不需能量的供给（3）拼接反应后，G与内元（414base）5’端以磷酸二酯键相连（放射性标记试验）
具体的拼接过程第一步：游离G发动的转酯反应G的3’-OH攻击内元的5’拼接点G-内元、左外元（有游离3’OH）
第二步：游离外元（左）发动的转酯反应左外元的3’-OH攻击3’拼接点，同时释放线状的内元,形成成熟RNA分子
☻两次转酯反应是紧密偶联的☻释放出的内元可继续进行转酯反应而形成环状
自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内元自身完成--------自我拼接的最大特点 转酯反应是将一处已有的磷酸二酯键变成另一处新的磷酸二酯键 内元自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反应的构象和活性位点,在G的参与下完成拼接反应(内部引导序列)这一机制如下图所示:
科罗拉多大学Cech等人完成（美）活性位点
内元的催化功能35SRNA前体拼接释放的内元（414base）进行的自身转酯反应（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化
A 16（线性片段）U20(线性片段)逆环化逆环化
C—15:逆环化将UUU加到5’端的能力表明:该环形产物具有连接两个RNA分子的能力（3）L—19：具有酶活性即Cech等人证明的L—19的polyC聚合酶活性
L—19分子
L—19分子
总结：a、四膜虫的35SRNA的内元有自身催化的性质即---将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷酸二酯键，不需要额外的能量因此：内元可以看作是RNA重排酶（RNA rearrangease）或RNA异构酶（RNA isomerase）其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后变成了不同的分子
b、L—19的polyC聚合酶活性进一步表明L—19具有酶的主要特征：专一性强加快反应速度反应前后酶分子保持不变人们称这种由RNA构成的酶为----核糖核酸质酶（ribozyme）可简称R酶
第二类内元的拼接1、拼接点序列7核苷酸的保守序列（Branch Site）3’拼接点上游6bp~12bp处 5’----exon-----GUGCG---------B.S----PyAU----exon---3’供点受点----Py Pu Py Py UAPy---100%
在Branch Site的两侧存在一些短的序列，与其上游10-50Nt处互成IR,形成茎环结构(但A不包含在IR序列内,从而被排除成芽状突起）5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’IntronIR IR5’ G AU 3’A
拼接机制（Splicing mechanism）Int ronIR IRA5’ G AU 3’Exon 1 Exon2 G AintronPyAUMatural RNA“Lariat”intron套索状内元转酯攻击位点intronOH AU2‘A3‘G
核基因mRNA内元的拼接1、相关概念Euk.的细胞中，有许多碱基数在100~300之间的小分子RNA,每个细胞有105~106个snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）2、核mRNA内元拼接的结构特点内元拼接与其他加工同时进行
拼接点序列Breathnach-Chambon rule（GU－AG规则） 5’---exon---GU--------intron--------AG------exon----3’供点100% 94%受点 7Nt branch site 3’拼接点的上游py X py U puApy
第一次转酯－－左外元、内元剪切套索lariat 第二次转酯－－exons连接、套索状内元释放 拼接体（spliceosome）解体与lariat降解同步
第九节不连续转录和反式拼接Discontinuous—transcriptionand Trans-splicing
顺式拼接：通过拼接将一个RNA分子的内元拼接掉，使外元连接在一起（cis-splicing）反式拼接：发生在两个RNA分子之间的拼接（trans-splicing）一、不连续转录的发现1982 Vander Ploeg等人研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时发现在其mRNA的5’端有35个bases是其基因中所没有的锥虫的全部mRNA都含有这个35bases序列称其为前导序列（leader sequence）
前导序列 由位于基因组其它区域的连续重复序列转录而来 200 copies左右 每个重复单位的3’端还有100base的一段序列（内元）因此一种完整mRNA的前导序列及特异基因编码的mRNA序列部分的转录是不连续的
每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的5’拼接点GU♫而完整mRNA的特异基因编码的mRNA序列的前面都有一个保守的3’拼接点AG,以及分支点A
反式拼接前导序列与特异基因编码的mRNA序列部分形成成熟的mRNA的拼接方式属反式拼接1986 W. J. Marphy和R. E. Sutton1、前导序列的3’区和mRNA的5’区各相当于一个内元的一半2、拼接过程形成Y型结构线虫的肌动蛋白基因、植物叶绿体基因
本章内容结束
上节课内容回顾:1、RNApol在DNA上结合位点的鉴定2、启动子的各部位与转录效率的关系3、真核生物RNApol：种类及各自转录的基因亚基组成4、RNApolⅡ的启动子5、RNApolⅢ的启动子
上节课内容回顾:1、转录的延伸2、转录的终止不依赖ρ因子的终止子终止转录依赖ρ因子的终止子终止转录3、抗终止
上节课内容回顾:1、Prok.转录产物的后加工rRNA tRNA2、Euk.转录产物的后加工尾巴的生成主体rRNA帽子结构
上节课内容回顾:1、pol(A)的生物学功能2、Euk.转录产物内元的去除tRNA内元的拼接内元的分类拼接方式的种类第类内元的拼接：结构特点、拼接机制
第Ⅰ类内元的拼接1、结构特点：（1）5’拼接点和3’拼接点-------U↓… …G↓(2)保守序列为5’－P－Q－R－S－3’距拼接点很远，各10~12bpP与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构(3)内部引导序列（interal guide sequence IGS）：内元中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列
科罗拉多大学Cech等人完成（美）活性位点
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