03 第三章 免疫球蛋白.pptx

第1页：第三章 免疫球蛋白

第三章 免疫球蛋白。

第2页：免疫球蛋白与抗体的概念

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）

指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。

抗体（antibody，Ab）

是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。

第3页：与抗体有关的诺贝尔奖获得者

与抗体有关的诺贝尔奖获得者：下表按年份列出主要获奖成果。

第4页：免疫球蛋白与抗体的关系

• 所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体
• 免疫球蛋白是结构和化学上的概念，抗体是生物学和功能上的概念
• 分泌型（secreted Ig，sIg）：存在于体液（血清、组织液、外分泌液）
• 膜型（membrane Ig，mIg）：即B细胞膜上的抗原受体

第5页：第一节 免疫球蛋白的结构

第一节 免疫球蛋白的结构。

第6页：免疫球蛋白的基本结构

四肽链结构：所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构，即两条重链（H）和两条轻链（L）。每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。

第7页：五类免疫球蛋白与对应重链

人类Ig根据重链稳定区的分子结构和抗原特异性不同分为五类；轻链可分为κ、λ两型。

第8页：重链与轻链

• 重链（Heavy chain，H链）：Ig的两条长链，可分为μ、γ、α、δ、ε链
• 轻链（Light chain，L链）：Ig的两条短链，可分为κ、λ型，每个Ig分子的两条轻链完全相同
• 对应的Ig依次为IgM、IgG、IgA、IgD、IgE

第9页：可变区与高变区

可变区：根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（V）和恒定区（C）。比较不同抗体V区的氨基酸序列，发现VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为高变区。三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区。

第10页：恒定区

恒定区：重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同类Ig的重链CH长度不一；同一种属动物中，同一类别Ig分子C区氨基酸的组成和排列顺序比较恒定。

第11页：铰链区

铰链区位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。

第12页：免疫球蛋白结构示意图

免疫球蛋白结构示意图，显示两条重链、两条轻链、可变区、恒定区与铰链区的组成关系。

第13页：高变区示意图

免疫球蛋白高变区示意图，显示VH和VL各三个高变区共同构成的抗原结合部位。

第14页：免疫球蛋白的功能区

免疫球蛋白的功能区：每个功能区约由110个氨基酸组成，其氨基酸序列具有相似性或同源性，二级结构是反向平行的β片层。

第15页：各类免疫球蛋白的功能区组成

免疫球蛋白的功能区组成：下表列出各类Ig轻链与重链所含功能区。

第16页：功能区的作用

VL、VH

超变区（互补决定区CDR），是与抗原特异性结合的部位

CL、CH1

同种异型的遗传标记

CH2、CH3（IgM）

补体C1q结合点，激活补体

IgG CH2

通过胎盘

IgG CH3

与单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、B细胞表面的FcγR结合

IgE CH2和CH3

与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc结合

铰链区

含大量脯氨酸，富有弹性和伸展性，使抗体能与不同距离的抗原决定簇结合，也利于暴露补体结合位点

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第19页：免疫球蛋白的水解片段

木瓜蛋白酶水解

水解IgG得到两个相同的Fab段和一个Fc段。

胃蛋白酶裂解

裂解IgG得到一个具有双价活性的F（ab′）2段和若干个小分子多肽碎片（pFc′）。

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第25页：J链和分泌片

连接链（J链）

由浆细胞合成的一种糖蛋白，IgA和IgM含有J链，可稳定Ig多聚体。

分泌片

是分泌型IgA（sIgA）的一个辅助成分，由粘膜上皮细胞合成和分泌；保护sIgA的铰链区免受蛋白酶水解破坏，介导IgA二聚体的转运。

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第27页：V区的功能

• 主要功能是识别和特异性地结合抗原，由V区特别是HVR（CDR）的空间构型所决定
• Ig单体可结合两个抗原表位，为双价
• 抗体与抗原结合后发挥免疫效应
• B细胞膜表面的IgM和IgD是B细胞识别抗原的受体

第28页：C区的功能

• 激活补体：IgM、IgG1～3与抗原结合后激活补体
• 结合细胞表面的Fc受体：调理作用、ADCC作用、介导Ⅰ型超敏反应
• 穿过胎盘和黏膜

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第33页：抗体的效应功能示意图

细菌或其它大分子抗原、细菌代谢产物抗原与抗体结合后：

1. 形成抗原抗体复合物
2. 结合细胞产生调理吞噬作用
3. 激活补体介导杀伤
4. 肥大细胞脱颗粒
5. 引起炎症反应

第34页：独特型与抗独特型抗体

抗体的抗原结合部位（antigen binding site）是抗原三维结构的“映象”。抗体的这一独特氨基酸结构称为独特型（idiotype）。

第35页：抗独特型抗体的制备

将某一抗体注射到另一个动物体内，可产生这一抗体的抗独特型抗体（anti-ids）。这一抗体“模仿”了抗原三维结构，可被用于作为疫苗。

第36页：抗独特型抗体疫苗的应用

把抗独特型抗体作为疫苗注入人体，可产生抗-抗独特型抗体（anti-anti-idiotype antibodies），它识别的结构与病毒（抗原）的结构相似，具有潜在的中和病毒的可能性。例如对乙型肝炎表面抗原反应的抗体的抗独特型抗体，可激发抗病毒的抗体。

第37页：IgG的特性与功能

• IgG于出生后3个月开始合成
• IgG为单体，半衰期约23天，血清含量最高，占血清免疫球蛋白总量的75%，是血清中主要的抗感染抗体
• IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激活补体

第38页：IgG的功能特点

• IgG是唯一能通过胎盘的抗体
• 通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合发挥调理作用；与NK细胞结合发挥ADCC作用；与葡萄球菌A蛋白结合可用于免疫学诊断和IgG抗体的纯化
• 具有抗菌、抗毒素和抗病毒作用
• 参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应

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第40页：IgM的特性

• 五聚体，是分子量最大的Ig，又称为巨球蛋白
• 个体发育过程中最早产生的抗体，胚胎晚期开始合成，新生儿脐带血中IgM水平升高提示胎儿曾有宫内感染
• IgM激活补体能力比IgG强
• 天然血型抗体

第41页：IgM的功能与意义

• IgM在早期免疫防御过程发挥重要作用，是血液中抗感染的主要抗体
• IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断
• 膜IgM是B细胞抗原受体的主要成分
• 参与Ⅱ、Ⅲ型超敏反应

第42页：IgM的结构

IgM结构图：五个IgM单体通过J链连接形成五聚体。

第43页：分泌型IgM与膜型IgM的比较

两种IgM的比较：分泌型IgM为五聚体并含J链；膜型IgM（mIgM）为单体，与Igα、Igβ异二聚体共同组成B细胞抗原受体复合物。

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第45页：B细胞表面IgM

B细胞表面IgM（mIgM）示意图，显示膜型IgM在B细胞膜表面的分布。

第46页：分泌型IgA与血清型IgA

血清型IgA

单体形式，存在于血清中。

分泌型IgA（sIgA）

双体形式，含J链（J chain）和分泌片（SC），是局部和粘膜免疫的主要Ig。

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第48页：IgD的特性

• IgD是B细胞的重要表面标志
• 未成熟B细胞仅表达mIgM
• 成熟B细胞同时表达mIgM和mIgD
• 活化B细胞或记忆B细胞表面的mIgD逐渐消失
• 膜型IgD是B细胞表面的抗原受体（BCR）

第49页：IgE的特性

IgE

又称亲细胞抗体。

作用机制

CH2和CH3功能区可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fcε受体（FcεR1）结合，引起Ⅰ型超敏反应。

第50页：第四节 多克隆抗体

多克隆抗体：用抗原免疫动物后获得的免疫血清（抗血清），由不同克隆的B细胞针对不同抗原决定簇所产生。

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第52页：多克隆抗体与单克隆抗体比较

多克隆抗体

多个抗原决定基刺激机体产生的多种抗体的混合物。

单克隆抗体（monoclonal antibody）

只针对某一特定的抗原决定基、纯度高的抗体。

第53页：单克隆抗体的概念

单克隆抗体概念：每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定簇反应的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。

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第58页：杂交瘤技术制备单克隆抗体流程

1. 动物免疫
2. 分离脾细胞、制备骨髓瘤细胞
3. 细胞融合
4. HAT培养基选择杂交瘤细胞
5. 阳性孔克隆化并扩大培养，再次克隆后扩大培养
6. 收集上清液或动物接种收集腹水
7. 单克隆抗体纯化保存（ELISA测定血清效价）

第59页：单克隆抗体制备的基本技术

1. 抗原提纯与动物免疫：抗原纯度要求高（电泳纯），选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠
2. 细胞的选择：经抗原免疫的B细胞（脾细胞）；肿瘤细胞（多发性骨髓瘤细胞Sp2/0）
3. 细胞融合：融合剂为聚乙二醇（PEG，常用聚合度1000～2000，浓度w/v 40%），细胞比例1:2～1:10（常用1:4），反应时间2～4分钟

第60页：HAT培养基与DNA合成途径

1. 培养基的选择：HAT培养基，含次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）
2. 细胞DNA合成一般有两条途径：由糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA（叶酸作为重要辅酶参与）；在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经HGPRT和TK催化合成DNA

第61页：HAT培养基的选择原理

1. 氨甲蝶呤（A）是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA
2. 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖
3. B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5～7天，且功能下降）
4. 融合细胞含有B细胞和瘤细胞的成分，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活

第62页：克隆化与扩大培养

1. 有限稀释法：将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔（36%的孔为1个细胞/孔），可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存
2. 显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养
3. 软琼脂平板法：下饲养层、上融合细胞分层培养后按显微操作法挑取
4. 细胞分选仪法：流式细胞仪分选

第63页：单抗制备纯化与细胞冻存

1. 单克隆抗体的制备、纯化：体外细胞株扩大培养取上清液提纯；接种小鼠腹腔取腹水提纯；按抗体纯化步骤进行纯化
2. 细胞株冻存和复苏：加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜（DMSO）冻存液后液氮（-196℃）保存。原则是慢冻（逐步降温，以每分钟降1℃为宜）、快融（立即浸入37～40℃水浴）

第64页：制备单克隆抗体的注意事项

1. 用降植烷（pristane）等油类制剂反复注入BALB/c小鼠腹腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞；应选择本身不产生Ig的SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株的对数期生长细胞作为融合细胞
2. 选择缺乏HGPRT或TK的细胞：采用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-AG）选育出缺乏HGPRT的细胞（HGPRT阳性细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT阴性细胞存活）；因培养过程中有个别细胞出现返祖现象，应定期用15～20μg/ml的8-AG处理细胞

第65页：TK缺陷细胞与饲养细胞

或利用5-溴脱氧尿嘧啶（BudR）诱发缺乏TK的细胞，一般选育缺乏TK的细胞较困难。

采用饲养细胞：单个或少数分散的细胞在体外不易生长繁殖，加入一定量的其他活细胞可促进原有细胞繁殖，这种加入的细胞即饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞、腹腔细胞、胸腺细胞以及大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞。

第66页：单克隆抗体的应用

1. 诊断（检测）试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等
2. 治疗：移植物受者使用T细胞的McAb可预防急性排斥反应；供体骨髓在体外经T细胞的McAb处理可减轻或消除移植物抗宿主反应；AIDS治疗；肿瘤介入治疗——细胞毒剂与抗肿瘤抗原的McAb结合，利用McAb的导向作用将药物定位于肿瘤细胞，直接杀死肿瘤细胞

第67页：单克隆抗体的应用概述

• 临床检测
• 抑制器官移植排斥
• 治疗自身免疫疾病
• 生物导弹

第68页：思考题

1. 抗体和免疫球蛋白的概念
2. 图示免疫球蛋白的基本结构、功能区以及功能
3. 简述免疫球蛋白的生物学活性
4. 免疫球蛋白的血清型有哪些？
5. 试述各类免疫球蛋白的特性和功能
6. 什么是单克隆抗体和多克隆抗体？