页数：34页文件大小：490.1 KB来源： 免疫学ppt课件
本课件介绍抗原抗体反应的特异性、定比性、可逆性等规律，讲解凝集反应、沉淀反应、单向与双向免疫扩散、免疫电泳、补体结合反应，并重点介绍免疫荧光、酶免疫测定 ELISA、放射免疫测定、免疫印迹与免疫电镜等标记技术的原理与应用。
免疫学技术及应用。
第一节 抗原或抗体的检测：抗原和相应抗体，无论在体内或体外相遇，均可发生各种各样的反应，统称为抗原抗体反应。
抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。
抗原抗体比例对反应现象的影响示意图：二者比例合适的等价带处形成的抗原抗体复合物最多、反应最明显，比例失衡时复合物减少。
血球凝集示意图：红细胞与相应抗体结合后形成的凝集现象。
沉淀反应（Precipitation）：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀；大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质进行琼脂扩散，故也称免疫扩散。
单向免疫扩散（Single Immunodiffusion）：是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。
双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型。
双向免疫扩散示意图：抗原与抗体自凝胶小孔相对扩散，在比例恰当处形成白色沉淀线。
双向免疫琼脂扩散常见孔型：三孔型、双孔型、梅花孔型、双排孔型。
将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。
免疫电泳（Immunoelectrophoresis）：为区带电泳与双向免疫扩散的结合。先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清，37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。
火箭电泳（Rocket Electrophoresis）：也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速测定标本中抗原的含量。
火箭电泳示意图：抗原在含抗体的琼脂中泳动形成的锥形沉淀峰，峰高与抗原含量成正比。
双向免疫电泳（two dimensional immuno-electrophoresis）：是一种将火箭电泳与血清免疫电泳相结合的方法。先将血清用电泳分离出各成分，然后切下凝胶板转移至另一已加有抗血清的凝胶上，进入垂直方向的第二次电泳，形成呈连续火箭样的沉淀线。
补体结合反应（Complement Fixation，CFT）：补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素（红细胞的特异性抗体）是否发生溶血反应作指示的一种高灵敏度的抗原与抗体结合反应。该方法敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。
免疫标记技术：用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。
免疫荧光显微技术（Immunofluorescence Technique）：是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC）与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。
间接免疫荧光法示意图：一抗与标本中抗原结合后，再用荧光素标记的二抗染色，在荧光显微镜下观察。
酶免疫测定（Enzyme Immunoassay，EIA）：是用酶（常用的有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP）标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA等。
酶联免疫吸附试验（ELISA）示意图：显示固相载体表面抗原抗体结合、洗涤去除游离成分及酶促显色的过程。
放射免疫测定法（Radioimmunoassay，RIA）：是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达ng水平。常用于标记的放射性核素有I-125和I-131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。
放射免疫测定法（RIA）原理示意图：标记抗原（Ag*）与待测抗原（Ag）竞争结合特异性抗体，形成Ag*-Ab和Ag-Ab复合物，分离后测定Ag*-Ab和游离Ag*的放射性，再从标准曲线上读取待测抗原含量。
RIA法原理及标准曲线：以未标记抗原浓度（ng/ml）为横坐标，结合/未结合的放射活性百分比为纵坐标绘制标准曲线，随未标记抗原浓度升高，结合的放射活性百分比下降。
免疫印迹法（Immunoblotting）：是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒如HIV的抗体或抗原。
免疫印迹法示意图：显示蛋白质经凝胶电泳分离、转移至固相载体后再用标记抗体检测的流程。
免疫电镜技术（immuno-electron microscopy，IEM）：是一种采用电子致密物质标记的抗体与其相应抗原发生特异性结合后，借电镜检出这一标记复合物的技术。
利用胶体金在碱性环境中带负电的性质使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需另外进行染色；在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。
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