20 医学免疫学实验2.pptx

第1页：实验脾细胞提取及计数

实验　脾细胞提取及计数

第2页：本次实验内容

本次实验内容

1. 眼球取血，血清分离
2. 脾细胞制备

第3页：实验设计示意

图示实验设计思路：T细胞致敏、B细胞分化为浆细胞并产生抗体的应答路径。

第4页：眼球取血的实验材料

实验1　血清分离——眼球取血

一、实验材料

• 免疫两周的小鼠（两人一只）
• 眼科弯镊子
• 麻醉剂（水合氯醛）
• 1ml注射器
• 1.5ml离心管

第5页：眼球取血方法

眼球取血方法

1. 小鼠腹腔注射麻醉剂0.4ml
2. 2min后抓住小鼠颈部皮毛，轻压在鼠笼上
3. 弯镊压入眼球深部带着结缔组织，匀速夹出眼球
4. 用微量离心管接住流出的血液，标记自己学号
5. 采血量尽量多
6. 竖直静置2小时

第6页：观看眼球取血录像

观看眼球取血录像

第7页：脾细胞分离材料

脾细胞分离材料

• 免疫两周的小鼠
• PBS（磷酸盐缓冲液）
• 70%酒精
• 细胞裂解液（0.17mol的NH4Cl）
• 动物解剖器械（平镊、齿镊、剪刀）
• 注射器（5ml）、平皿、Ep管、15ml离心管、离心机

第8页：取脾操作

取脾

1. 将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死
2. 70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位
3. 左侧肋骨最低点与髋关节间做2.5cm切口
4. 镊子钝性分离结缔组织，暴露腹膜
5. 腹膜做2cm切口，暴露脾脏
6. 分离结缔组织和系膜
7. 脾脏放入5ml PBS的平皿中

第9页：冲洗法提取脾细胞

冲洗法提取脾细胞

1. 平镊轻轻夹住脾
2. 注射器吸取平皿中5ml PBS，匀速注射入脾脏，冲洗脾细胞
3. 拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS，插上针头刺入脾脏冲，反复冲洗3次，脾脏由暗红色变为白色
4. 把所获得的细胞悬液收集到离心管内，PBS补齐至8ml

第10页：取脾与冲洗注意事项

注意事项

• 脾脏很脆，一定要用平镊轻夹
• 分清脾脏和肝脏
• 冲洗脾细胞时针头不能穿透脾脏
• 倾倒上清时沉淀贴壁面朝上，可剩余少量上清，防止误倒细胞
• 红细胞裂解液4℃保存
• 解剖器械用后及时清洗

第11页：观看取脾视频

观看取脾视频

第12页：脾细胞悬液制备

脾细胞悬液制备

1. 1500rpm离心10min，去上清
2. 加2ml红细胞裂解液，悬起细胞，可用加样器吹打混匀细胞，室温静止5min
3. 加6ml PBS后，1500rpm离心5min，去上清
4. 5ml的PBS悬浮细胞，2000rpm离心10min，去上清
5. 1ml的PBS悬浮细胞

第13页：脾细胞计数材料

脾细胞计数材料

• 细胞计数板
• 盖玻片
• 显微镜
• 微量加样器

第14页：细胞计数板与浓度公式

细胞计数板

细胞浓度＝稀释倍数 × 4个方格的平均数 × 10⁴／ml

第15页：脾细胞计数规则

图示脾细胞计数规则，展示计数板中方格的分布与压线细胞的取舍原则。

第16页：脾细胞计数方法

脾细胞计数方法

1. 盖玻片盖好计数板
2. 取10μl注入计数板与盖玻片夹层
3. 40X物镜下计数细胞
4. 计算细胞原液浓度
5. 调整细胞浓度至2×10⁶／ml

第17页：收集血清

收集血清

1. 10000rpm离心10min
2. 微量加样器沿管壁缓慢吸取上清并转移至新Ep管，标记
3. 保存在－20℃冰箱备用
4. 注意勿将红细胞吸出

第18页：试验台恢复初始状态

试验台回复初始状态！！！

• 平皿、鼠板冲洗干净倒放在实验台上；
• 15ml离心管冲洗干净倒放在试管架上；
• 5ml注射器冲洗干净倒放在试管架上；
• 红细胞裂解液、麻醉剂、PBS上交；
• 每组清点手术器械（1把手术剪刀、2把齿镊、2把平镊、1把眼科镊）并冲洗干净上交；
• 清理实验台垃圾。