19 医学免疫学实验1.pptx

第1页：按学号入座

按学号入座　讲台

第2页：医学免疫学实验课

医学免疫学实验课

第3页：实验课要求

实验课要求

• 实验课占总成绩30%，其中实验设计20%，课堂表现10%
• 准时，注意课堂纪律
• 穿白大衣；贵重物品随身携带
• 爱惜实验室设备和器材；注意水、电、煤气
• 认真做实验记录；课后恢复实验台初始状态；分组值日

第4页：加样枪量程与使用方法

加样枪使用方法及注意事项

• 选择适当量程的加样器
• P20：0.5～20.0 µl；P200：20～200 µl；P1000：200～1000 µl
• 转动旋钮，调整量取体积：顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积
• 禁止超出量程范围，否则会损坏加样器
• 拇指操作加样器芯，其它四指弯曲握住加样器

第5页：加样器操作注意事项

加样器使用方法及注意事项

• 安装相应的枪头：白色P20；黄色P200；蓝色P1000
• 注意无菌操作
• 按加样器芯时会遇到两个阻力点：到达第一个阻力点时为量取液体的体积；只在完全排出液体时才使用第二个阻力点
• 吸取液体时只需按到第一个阻力点
• 实验完成之后，将加样器调至最大量程

第6页：ELISA包被与封闭操作步骤

操作步骤

1. 加包被液（SRBC）每孔100μl，37℃ 40min
2. 洗板2次，弃上清，加封闭液，每孔200μl，37℃，1小时
3. 弃去孔中液体，洗板1次
4. 每2名同学1条反应板，在板子侧面标学号
5. 拍干板条，4℃保存备用

第7页：实验内容安排

实验内容

实验一

ELISA实验准备（包被、封闭）；抗原抗体反应（小鼠腹腔免疫）；玻片法凝集实验检测血型

实验二

血清分离；脾细胞制备和分离

实验三

血清抗体的检测（ELISA）；妊娠检测实验（胶体金免疫层析法）

实验四

对流免疫电泳；溶血实验；NO检测

第8页：ELISA实验准备的试剂与材料

一、ELISA实验准备（包被、封闭）

试剂与材料

• 绵羊红细胞（SRBC）裂解液
• 封闭液（5% BSA／PBS溶液）
• 洗涤液（PBS＋Tween，pH7.4）

第9页：ELISA反应原理

图示ELISA反应原理：固相SRBC碎片（Ag）＋待测血清（Ab）＋酶标二抗＋底物 → 产物显色。

第10页：小鼠抓取方法

小鼠抓取方法

1. 用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部，放在铁笼上，小鼠自然向前挣扎
2. 用左手食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠
3. 用左手小指和无名指压住小鼠尾部，固定小鼠

注意：小鼠尾巴的尾端容易断裂，抓小鼠应抓尾巴中部或根部。

第11页：小鼠的抓取及固定

图示小鼠的抓取及固定（1）（2）（3）三个步骤。

第12页：小鼠腹腔注射

腹腔注射

1. 左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上
2. 右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左右
3. 使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感
4. 固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液或尿液后即可注射

第13页：小鼠标记

图示小鼠标记（苦味酸）方法。

第14页：小鼠腹腔免疫

二、小鼠腹腔免疫

• 4人一组（先发PBS对照，同时1ml绵羊血，离心2000rpm，6min，做完后发SRBC）
• 2人一只小鼠
• 实验组：腹腔注射2%的SRBC 1ml
• 对照组：腹腔注射PBS 1ml

第15页：绵羊红细胞的制备

绵羊红细胞（SRBC）的制备

1. 小心吸弃上清，留红细胞沉淀
2. 加入1ml PBS混匀即为2%绵羊红细胞悬液

第16页：小鼠免疫注意事项

注意事项

• 注射之前排空注射器中的空气
• SRBC使用之前要混匀
• 小鼠会咬人，一定固定好头部
• 最好一次成功，否则老鼠会受到惊吓
• 进针后的落空感
• 记住小鼠的标记，做好记录
• 注射器使用后清洗干净

第17页：抗原抗体反应的概念与特点

三、抗原抗体反应

抗原抗体反应

指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

抗原抗体反应的特点

特异性；可逆性；比例性；阶段性

第18页：抗原抗体反应的特异性

特异性

抗原与抗体结合反应的专一性。

分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。

第19页：抗原抗体反应的可逆性

可逆性

抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性。

影响因素：抗体对相应抗原的亲合力——亲合力越高，结合越牢固，越不易解离；环境因素对复合物的影响——pH、离子强度。

第20页：抗原抗体反应的比例性

比例性

抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系。

• 前带（prezone）：抗体过量
• 后带（postzone）：抗原过量
• 等价带（equivalence zone）：抗原抗体比例合适

第21页：抗原抗体反应的阶段性

阶段性

第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见；第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。

第22页：凝集反应的概念与分类

1、凝集反应

在颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原），在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。

凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。

分类：直接凝集反应；间接凝集反应。

第23页：直接凝集反应

直接凝集试验

颗粒性抗原在有电解质参与下，直接与相应抗体结合出现的凝集现象。

直接凝集反应：1.玻片凝集试验；2.试管凝集试验。

第24页：间接凝集试验

图示间接凝集试验（正向）：载体吸附可溶性抗原形成致敏颗粒，与待测抗体反应出现凝集颗粒。

第25页：反向间接凝集试验

图示反向间接凝集试验：以已知抗体致敏载体形成致敏颗粒，与待测抗原反应出现凝集。

第26页：洗板与封闭操作提示

取出板，分发后进行洗板、封闭，调至幻灯片6，再次回收至保温箱。

第27页：玻片法测定血型

实验：玻片法测定血型（观看视频）

第28页：血型测定的试剂与器材

试剂与器材

• 人外周血红细胞
• 抗－A及抗－B标准血清
• 生理盐水
• 载玻片、采血针、消毒棉球等

第29页：玻片法血型测定操作方法

操作方法

1. 酒精缸内取清洁玻片一张，两侧各加一滴抗A及抗B血清
2. 采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的两个角分别取血，与抗体混合
3. 轻轻摇动玻片，经1～2分钟后肉眼观察结果
4. 出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应，仍为均匀混悬液者为阴性反应

第30页：

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第32页：沉淀反应

2、沉淀反应

可溶性抗原（如细菌培养滤液、外毒素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在一定条件（适量的电解质，合适的酸碱度和温度）下，形成肉眼可见的沉淀现象，这个过程称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen），其相应抗体称为沉淀素（precipitin）。

第33页：凝胶内沉淀试验

凝胶内沉淀试验：可溶性抗原和抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在二者比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。包括：1.单向扩散试验；2.双向免疫扩散试验。

扩散试验原理

抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散。

第34页：单向免疫扩散

单向免疫扩散

将抗体预先混入琼脂中，铺板，然后在板上打孔，孔中加入抗原。因为抗原能在琼脂中扩散，所以在抗原抗体比例适宜处形成白色沉淀环。环的直径与抗原量成正相关。

第35页：单向免疫扩散结果分析

结果分析：标准品稀释度 1:8、1:36、1:72、1:144、1:288 及NS对照组对应的沉淀环直径用于绘制标准曲线。

说明：原文仅给出稀释度标签，未抽出各孔沉淀环直径数值，建议对照原课件图片核对。

第36页：双向免疫扩散

双向免疫扩散

当抗原和抗体加入含有适量电解质的琼脂凝胶的相邻的孔中，它们向四周扩散，若两者相互对应，分子比例适合，在扩散一定时间后在两孔之间相遇并结合生成白色沉淀线。

第37页：双向免疫扩散结果分析

结果分析

• 抗原或抗体是否存在；
• 抗原或抗体的纯度；若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。

第38页：

第39页：双向免疫扩散试教实验

试教实验（展示琼脂样板）双向免疫扩散实验

目的

定性检测人血清AFP

试剂与器材

1.5％琼脂；人血清样品1和样品2；阳性对照血清；抗人AFP抗体；琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒，温箱

第40页：洗板操作提示

取出孵育板子，发放滤纸条，洗板，拍干。

第41页：实验设计要求

四、实验设计

• 由学生根据所学知识和文献报道，提出有创新性的科学假设；利用所学习的免疫学理论课和实验课知识，设计实验方案，来证实或证伪科学假设。
• 具有创新性、科学性和可行性。

第42页：实验方案内容

实验方案内容

第43页：实验设计评价标准表

免疫学实验课实验设计评价标准

第44页：实验设计报告提交要求

实验设计报告提交要求

• 1500字以上
• 立题依据和实验方法应给出参考文献
• 参考文献应注明作者、题目、出处、页数等信息
• 电子版形式上交，附件形式，标题是学号和姓名，发至邮箱