页数：41页文件大小：658.0 KB来源： 发酵工艺原理ppt课件
本课件讲解工业化生产菌种必须具备的条件与微生物特性，比较抗生素、氨基酸、食品酶制剂生产菌及常用基因表达系统；随后系统介绍从采样、富集到菌落选出的分离原则，以及自然选育、诱变育种、结构类似物抗性与DNA Shuffling等育种手段。
第二章 菌种的来源，本章要点：
微生物的特性：
工业化菌种的要求：
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。
图示黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制，图中标注关键酶：
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。
开发一个新酶都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶生产菌：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
（一）原核生物表达系统：大肠杆菌（1977年Boyer）、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌。特点：
（二）真核细胞表达系统——酵母（既是微生物又是真核细胞）：
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统：
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但涉及工业化生产，对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。
例：礼来（Eli Lilly）花了10年时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
菌种分离的一般过程：
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。
关键问题：如何使样品中所含微生物的可能性大，如何在后续操作中使这种可能性实现。
采样时要注意的问题：
富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
富集的三种方案：
定向培养的方法：物理方法包括加热、膜过滤等（表2-2，P31），但主要是通过培养的方法实现富集。
定向培养的富集方法：
一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，经培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。
四、菌落的选出：
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）
流程：采样（造纸厂）→ 80℃、30分钟处理
文献报道产生菌为中性芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌；采用0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落。
结果：从285个土样中获得62株，其中26株为组成型、36株为诱导型。
例：醛肟水解酶的筛选（Journal of Biotechnology 94(2002), 65-72）
培养基中含0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去一半培养物并补充新鲜培养基，不断分析样品；2-3个月后Z-PAOx降低，再稀释分离出菌落。
分子生物学实验手段在微生物鉴别及特定目标产物筛选方面发挥越来越重要的作用，如16S rRNA同源性分析、基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等。
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点（2002，陈文新，科学院院士）。
现代分子生物学技术支持DNA文库表达筛选，可获得"非可培养"生物来源的酶。例如Diversa公司从一个碱性土壤样品总DNA的16%中识别出120种独特的酯酶/脂肪酶。
第四节 菌株选育、分子改造的目的：
菌株选育的方法：
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。自然突变有两种情况：
自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。
回复突变：高产菌株在传代过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失、生产性能下降，这种情况称为回复突变。
问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化，操作步骤：
诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选。
（一）诱变剂的作用原理（略）。
（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题：
常用灭活处理：亚硝酸用0.07M Na2HPO4；亚硝基胍用1M NaOH。
（三）诱变育种的一般步骤（P83）；（四）筛选的方法：
图示黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制，图中标注：
下表列出黄色短杆菌F9-50的诱变谱系及赖氨酸产量的逐代提高。
| 菌株 | 遗传标记 | 赖氨酸产量（lys·HCl） |
|---|---|---|
| Brevibacterium flavum As1.495 | leu- | 2.1 g/l |
| F6-16 | leu-、Thr- | 20.8 g/l |
| F9-50 | leu-、Thr-、AECr | 33.5 g/l |
基因的直接进化（directed evolution）：在分子水平上对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法提高目标蛋白的性能。步骤：
主要应用：酶学性能的提高，使酶由生理环境走向工业催化环境。
例：脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯（PLA光学拆分）。经5次易错PCR、2次定点突变（Reetz 1997；Liebeton 2000），选择性（%）逐轮提高：
| 进化轮次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 选择性（%） | 2 | 31 | 57 | 75 | 81 | 90 |
说明：原课件仅给出2、31、57、75、81、90六个数值序列，本表按"5次易错PCR＋2次定点突变"的轮次顺序依次排列，供对照原图核校。
定点突变：在目标基因的特定位置引入碱基替换，从而改变蛋白质特定位点的氨基酸，是有针对性的基因改造手段，原理以原课件图示为准。
易错PCR：在PCR扩增中降低复制保真度，使目标基因随机引入突变，从而建立突变基因库，流程以原课件图示为准。
DNA Shuffling：指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组（Sexual Recombination）。
DNA Shuffling流程：用DNAse I将基因切成片段（Fragment），重新组装（Reassemble）形成重组子，筛选最优重组体（Select best recombinants），并多轮循环（Repeat for multiple cycles）。
下表从进化速度、进化对象、进化周期、影响对象与突变效率五个方面比较两种方式。
| 项目 | 常规定向进化 | DNA Shuffling |
|---|---|---|
| 进化速度 | 缓慢进化 | 快速进化 |
| 进化对象 | 整个基因组 | 特定基因/操纵子/病毒 |
| 进化周期 | 多年 | 几天 |
| 影响对象 | 完整基因组 | 部分基因组 |
| 突变效率 | 低 | 高 |
下表列出定向进化在不同生物产品上的活性增加倍数与潜在应用领域。
| 类型 | 示例 | 特性 | 活性增加倍数 | 潜在应用领域 |
|---|---|---|---|---|
| 抗体 | 人源抗体 | 亲和性 | 400 | 生物制药 |
| 酶 | 天冬氨酸转氨酶 | 催化特异性 | 10000 | 生物制药 |
| 酶 | β-内酰胺酶 | 抗生素抗性 | 32000 | 抗生素 |
| 酶 | 枯草杆菌蛋白酶E | 耐热性65℃耐热时间 | 17200 | 工业酶 |
| 细胞因子 | 人类干扰素 | 抗病毒 | 285 | 生物制药 |
本章小节：
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