03 第三章 灭菌.ppt

第1页：第三章 灭菌 目录

第三章 灭菌（sterilization），本章要点：

• 灭菌的原理及方法
• 培养基和发酵设备的灭菌工艺
• 空气除菌

第2页：灭菌的定义

灭菌

指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。

第3页：化学物质灭菌的原理与使用范围

1．化学物质灭菌

原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性、酶失活。

使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌。

第4页：常用的灭菌剂及其有效浓度

下表列出常用化学灭菌剂的名称与有效浓度。

第5页：辐射灭菌的原理与使用范围

2．辐射灭菌

原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用：紫外线、X射线和γ射线。

使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。

第6页：干热灭菌的原理与使用范围

3．干热灭菌

原理：利用高温对微生物的氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃、1-2小时。

使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌。

第7页：湿热灭菌的原理与使用范围

4．湿热灭菌

原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下蛋白质易变性。常用方法：水煮常压灭菌100℃；饱和蒸汽灭菌一般121℃、30分钟。

使用范围：培养基和发酵设备灭菌。

第8页：过滤除菌的原理与使用范围

5．过滤除菌

原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。方法：0.01~0.45 μm孔径滤膜。

使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

第9页：湿热灭菌原理：对数残存定律

1．生物热死动力学（对数残存定律）：

dN/dt = -K·N

• N：菌体个数（个）；t：灭菌时间（min）；K：反应速度常数（min^-1）
• dN/dt：菌受热死亡速率（个/min）
• ln(N/N₀) = -K·t，即 N = N₀·e^-Kt

以菌的残留数ln(N/N₀)对时间t作图得一条直线，其斜率为-K（P222 图14-1）。

第10页：反应速率常数K与菌种特性

如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度、某一微生物的K？

1）K与菌种的特性有关：相同温度下，微生物越耐热，K值越小；越不耐热，K值越大。

2）反应速率常数K与灭菌温度有关。

第11页：K与灭菌温度的关系（阿累尼乌斯方程）

2）K与灭菌温度的关系符合阿累尼乌斯方程：

K = A·e^-E/RT，即 lnK = lnA - E/RT

• A：比例常数；R：气体常数（J/mol·K）；T：绝对温度（K）
• ΔE：杀死细菌所需的活化能（J/mol）

图中对比121℃、118℃、115℃、110℃、105℃下的灭菌效果差异。

第12页：培养基灭菌时间的选择

一、培养基灭菌时间的选择：

t = (1/K)·ln(N₀/N)

• K：一般耐热的细菌芽孢的K值
• N₀：细菌及芽孢数之和
• N：10^-3

第13页：培养基灭菌温度的选择

二、培养基灭菌温度的选择：选择既能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度。

第14页：培养基营养成分破坏动力学方程

1．培养基营养成分破坏动力学方程：

-dC/dt = K'C

• -dC/dt：营养物降解速度（mol/L·h）；C：营养物浓度（mol/L）
• K'：营养物降解反应速度常数（1/s）；t：时间（s）
• ln(C/C₀) = -K't
• K' = A'e^-E'/RT，即 lnK' = lnA' - E'/RT
• E'：营养物破坏所需的活化能（J/mol）

第15页：灭菌反应与营养物破坏反应的比较

2．根据实验结果，灭菌活化能大于培养基破坏活化能，即 E > E'（P225 表14-1）。

3．灭菌反应与营养物破坏反应在不同温度T₁、T₂下：

• ln(K₂/K₁) = E/R·(1/T₁ - 1/T₂)
• ln(K'₂/K'₁) = E'/R·(1/T₁ - 1/T₂)
• ln(K₂/K₁) / ln(K'₂/K'₁) = E / E'

因 E > E'，故 K₂/K₁ > K'₂/K'₁：当温度升高时，微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大。

第16页：高温短时（HTST）灭菌的依据

4．结论：达到相同灭菌效果，温度T越高，K越大，所需时间t越短，因此采用高温短时（HTST）灭菌效果好。

第17页：影响灭菌效果的因素

三、影响灭菌效果的因素：

• 微生物种类：不同的微生物K值不同
• 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t与初始菌量N₀的对数成正比
• 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性
• 传热与混合状况：影响受热均匀度
• 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透
• 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度
• pH：酸性pH下可加快微生物热死速率

第18页：实验室种子培养基的灭菌方法

（一）实验室种子培养基灭菌方法：使用高压蒸汽灭菌锅。

• 手提式灭菌锅：容量小
• 立式或卧式灭菌锅：容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶
• 灭菌柜：要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶（袋）

第19页：分批灭菌的定义

（二）分批灭菌（batch sterilization）

1．定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。

第20页：分批灭菌的操作过程

2．操作过程：

1. 空罐准备：清洗、检修和检测
2. 升温：把培养基加热到灭菌所需的温度
3. 保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间
4. 冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度

第21页：分批灭菌温度随灭菌时间的变化

图示分批灭菌过程中温度随灭菌时间的变化：依次经历升温、保温维持与冷却三个阶段，曲线以原课件图示为准。

第22页：分批灭菌的三路进汽、四路出汽

三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。

四路出汽：蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排出。

设备布置见分批灭菌设备示意图。

第23页：连续灭菌的定义与流程

（三）连续灭菌（continuous sterilization）

1．定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。

2．流程：

1. 由热交换器组成的灭菌系统
2. 蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统
3. 由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统

第24页：由热交换器组成的灭菌系统工艺流程

图示由热交换器组成的连续灭菌系统工艺流程：培养基经预热、加热灭菌与冷却后进入已灭菌的发酵罐，流程以原课件图示为准。

第25页：热交换器灭菌的温度—时间曲线

图示热交换器连续灭菌系统中温度随时间的变化：升温与冷却迅速，高温维持时间短，曲线以原课件图示为准。

第26页：蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统

图示蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统：蒸汽直接喷入培养基快速升温，经维持段后冷却，系统组成以原课件图示为准。

第27页：蒸汽直接喷射灭菌的温度—时间曲线

图示蒸汽直接喷射型连续灭菌过程中温度随灭菌时间的变化，曲线以原课件图示为准。

第28页：由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统

图示由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的连续灭菌系统：培养基在连消塔内快速升温，在维持罐中保温，再经喷淋冷却降温，设备组合以原课件图示为准。

第29页：连续灭菌与分批灭菌的比较与选择

分批灭菌

优点：不需附加设备；蒸汽利用率高；节约劳动力。缺点：培养基质量比较差；罐的利用率低；冷却水用量大。

连续灭菌

优点：采用高温快速灭菌法；可以把培养基按其性质分开灭菌；有利于自动控制；节省冷却水。缺点：投资费用高；对物料要求高；蒸汽用量大。

选择原则：1．培养基成份（易降解成分、液化情况等）；2．设备状况（冷却面积、传动装置等）；3．动力条件。

第30页：灭菌方式的选择原则

选择原则：

1. 培养基成份（易降解成分、液化情况等）
2. 设备状况（冷却面积、传动装置等）
3. 动力条件

第31页：高温对培养基成分的有害影响及其防止

四、高温对培养基成分的有害影响及其防止：高温会造成营养成分破坏、沉淀生成等不良影响，需采取相应措施加以防止。

第32页：消除高温有害影响的措施

消除高温有害影响的措施：

1. 采用特殊加热灭菌法（连续灭菌方法）
2. 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并
3. 对含Ca²⁺或Fe³⁺的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀
4. 对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌

第33页：无菌空气的要求：空气中的微生物

一、无菌空气的要求——空气中的微生物：

• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母、霉菌孢子和病毒
• 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为10³~10⁴个/米³
• 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒（0.6-1μm）

第34页：无菌空气的标准

无菌空气的标准：

第35页：介质除菌的原理与主要设备

二、介质除菌

原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。

主要设备：填充床过滤器

1. 纤维或颗粒介质填充床过滤器：棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等
2. 折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：超细玻璃纤维
3. 烧结金属、陶瓷过滤器

第36页：发酵生产中制备无菌空气的大致过程

图示发酵生产中制备无菌空气的大致过程：取气、压缩、冷却分离、加热与过滤除菌等环节，流程以原课件图示为准。

第37页：空气介质除菌流程与高空取气

高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

第38页：两级分离、冷却、加热的空气除菌流程

两级分离、冷却、加热的空气除菌流程，设备依次为：

1. 粗过滤器
2. 压缩机
3. 贮罐
4. 冷却器
5. 丝网分离器
6. 过滤器

第39页：高效前置过滤除菌流程

高效前置过滤除菌流程，设备依次为：

1. 高效前置过滤器
2. 压缩机
3. 贮罐
4. 冷却器
5. 丝网分离器
6. 加热器
7. 过滤器

第40页：膜过滤除菌的原理与滤膜材质

三、膜过滤（绝对过滤）

原理：利用微孔滤膜（microporous membrane）对空气进行过滤，膜的孔径0.2-0.45微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。

膜过滤器材质：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、聚丙烯、纤维素脂膜等。