页数：53页文件大小：410.5 KB来源： 发酵工艺原理ppt课件
本课件从培养基的定义与按纯度、状态、用途三种分类讲起，依次介绍孢子、种子与发酵培养基的配制要求；随后系统讲解碳源、氮源、无机盐与微量元素、水、生长因子、前体与产物促进剂的作用，最后给出培养基成分选择原则与优化程序及工业培养基判据。
4．微生物培养基（Cultural media）
A cultural medium is the substance in which a specific organism lives and grows. It must contain the essential nutrients needed for the microbe to grow. 一个好的培养基应满足微生物生长与产物合成的需要。
4.1 培养基的类型及功能
按纯度分类：
合成培养基适用于生物化学或代谢研究；一般实验室培养常用天然培养基。
The choice of defined or undefined medium is dependent upon its application.
按状态分类：
按用途分类：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
1．孢子培养基（spore media）要求：使菌体迅速生长，产生较多的优质孢子，不易引起菌种发生变异。基本配制要求：
生产上常用孢子培养基：麸皮、大米、小米培养基；由葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。
大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因它们含氮少、疏松、表面积大，是较好的孢子培养基，水分控制在21%－25%。
种子培养基（inoculum media）：供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的"种子"。
Inoculum media are usually less nutritious than production media, and they usually contain a considerably lower level of the main nutrients.
一般种子培养基常包括有机氮源和无机氮源；最后一级的种子培养基的成分最好接近发酵培养基。
发酵培养基（production media）：供菌体生长、繁殖和合成产物之用。要求：既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体迅速合成所需产物。
配制要求：其组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还需有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
In addition to the carbon and nitrogen compounds, a medium contains inorganic salts, vitamins, growth factors, precursors of fermentation products.
Microbial growth under industrial fermentation conditions usually utilizes a "luxury metabolism" of the organisms. Thus, good yields of fermentation products occur only if relatively large amounts of carbon, and possibly nitrogen, are channeled through the metabolic pathways of the microorganism.
4.2 发酵培养基的成分及来源：培养基的组成可简可繁，取决于特定的微生物及其发酵类型。
4.2.1 碳源（carbon sources）：碳源是培养基的主要成分之一，其功能是提供碳和能量，以及合成产物的组分。可用的碳源包括单糖、复杂碳水化合物、醇类、氨基酸和其他有机酸以及短链脂类。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇，蛋白质、氨基酸也可用作碳源。
糖类（sugars）主要使用葡萄糖、糖蜜（molasses）、糊精（dextrin）。
Glucose：多数微生物都能利用。属速效碳源，high concentration → speed respiration up → DO not enough → intermediates accumulation → inhibiting growth（浓度过高会加快呼吸造成溶氧不足，引起中间产物积累并抑制生长）。
糖蜜（molasses）：甜菜和甘蔗糖蜜是制糖工业的副产物，含50%-75%可发酵糖（主要为蔗糖），还含氮化合物、维生素和矿物质，价格便宜（Cheaper）。
淀粉和糊精（starch and dextrin）：淀粉广泛用于发酵工业，经微生物淀粉酶水解为糊精再到葡萄糖。常用的有玉米、小麦、马铃薯淀粉以及玉米粉。优点：属缓效碳源，比葡萄糖便宜。
油和脂肪（oils and fats）：某些微生物含脂肪酶（lipase），可利用油脂作碳源。脂肪 → 甘油（glycerol）和脂肪酸 → 氧化生成CO2和水，释放大量能量。提供充足的O2十分重要。常用的油：豆油、菜子油、猪油、鱼油、棉子油等。
有机酸（organic acids）：有些微生物可以利用乳酸、柠檬酸、醋酸等作碳源，利用后培养基的pH会升高（如 CH3COONa + O2 → 2CO2 + H2O + NaOH）。
烃和醇类（hydrocarbon and ethanol）：石油及裂解产物如正烷烃也可用作碳源；自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍。
4.2.2 氮源（nitrogen sources）：氮源主要用于构成细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。
有机氮源常用的有：花生饼、棉子饼、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。有机氮源经微生物蛋白酶水解为氨基酸后被利用。
有机氮源含丰富的蛋白质、肽类、氨基酸、维生素和生长因子。在含有机碳源的培养基中，微生物常表现出生长旺盛、菌丝或细胞浓度增长迅速的特点。有些微生物对氨基酸有特殊需求，如缬氨酸可提高红霉素的发酵单位。
玉米浆是玉米淀粉等玉米产品工业化生产中浸泡玉米的水提取副产物。其50%固形物中近一半为乳酸，其余包括氨基酸、葡萄糖和其他还原糖、盐类、维生素以及前体（如青霉素分子的前体）。高乳酸含量来自生产过程中乳酸菌的生长。
玉米浆的这种组成变化（This variation in composition）有时会导致工业发酵的重现性差（poor reproducibility of an industrial fermentation）。
尿素（urea）也是常用的氮源。其特点：成分单一，不具备复合氮源的营养特征；价格便宜，常用于青霉素和谷氨酸的生产。
酵母膏（yeast extract）、蛋白胨（peptones）：有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体。缬氨酸、半胱氨酸和α-氨基己二酸是合成青霉素和头孢菌素的主要前体；甘氨酸可作为L-丝氨酸的前体等。
无机氮源：常用的有氨水（ammonia）、铵盐（ammonium）和硝酸盐（nitrate），微生物利用较快，被利用后会改变培养基的pH。
(NH4)2SO4 → 2NH3 + H2SO4；NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
生理酸性物质：NH4+被利用后生成酸性物，如硫酸铵；生理碱性物质：生成碱性物，如硝酸铵。要正确使用生理酸碱性物质。
氨水除作氮源外，还常用于调节培养基pH，使用时需搅拌。
4.2.3 无机盐及微量元素（mineral salts and trace elements）：微生物细胞生长繁殖时需要。常见的有磷（phosphorus）、镁（magnesium）、硫（sulphur）、钾（potassium）、钠（sodium）、铁（iron）、氯（chlorine）、锰（manganese）、锌（zinc）、钴（cobalt）、钙等。
无机盐与微量元素作为微生物细胞生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。浓度低时对细胞生长和产物合成有促进作用，浓度高时会抑制细胞生长，其最适浓度取决于菌种和菌株。
下表列出培养基中无机盐成分一般所用的浓度范围（g/L）。
| 成分 | 浓度（g/L） | 成分 | 浓度（g/L） |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | 1.0~4.0 | ZnSO4·8H2O | 0.1~1.0 |
| MgSO4·7H2O | 0.25~3.0 | MnSO4·H2O | 0.01~0.1 |
| KCl | 0.5~12.0 | CuSO4·5H2O | 0.003~0.01 |
| CaCO3 | 5~17 | Na2MoO4·2H2O | 0.01~0.1 |
| FeSO4·4H2O | 0.01~0.1 | — | — |
这些元素以盐的形式加入培养基。除合成培养基外，钴、铜、铁、锰、锌、钼等一般不加入天然（粗）培养基中。
磷是核酸和蛋白质的组成成分之一，也是ATP的组分，参与能量传递。磷能刺激微生物生长和代谢，但浓度高时会抑制细胞生长。许多次级代谢过程对磷酸盐浓度的承受限度比生长繁殖过程低，故必须严格控制。
镁不参与细胞结构组成，但Mg是许多重要酶的激活剂，如己糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶等。镁离子可提高抗生素产生菌的抗生素耐受能力，如链霉素、卡那霉素等产生菌，常以硫酸镁的形式加入培养基。
硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组分和某些辅酶的活性基，如辅酶A、谷胱甘肽等。硫也是青霉素、头孢菌素等分子的组成部分，培养基中加入Na2SO4等含硫化合物作硫源。
铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分，因此是菌体有氧氧化必不可少的元素。在铁制发酵罐中，铁离子浓度一般可达30 µg/ml，所以工业培养基中不必另加含铁化合物。
氯对多数微生物没有营养功能，但嗜盐菌生长必需。一些产含氯代谢物如金霉素和灰黄霉素的发酵中，除天然含有外通常还需加入0.1%氯化钾。在啤酒生产中，20－60 mg/ml的氯对酶和酵母有一定的促进作用。
钠、钾、钙不是细胞结构的组成成分，但仍是培养基的必要成分。钠、钾离子与维持细胞的渗透压有关，钾离子是许多酶的激活剂，能促进糖代谢；钙是某些酶（如蛋白酶）的激活剂，还参与细胞膜通透性的调节。培养基中钙盐过多时会形成磷酸钙沉淀。
锌、镁、钴、锰等是某些酶的辅基或激活剂。镁离子还可提高抗生素生产菌对自己所产生抗生素的耐性；钴既是一些酶的激活剂，又是维生素B12的组成元素，发酵中加入一定量的钴盐能使B12产量提高数倍；锰对于羧化作用是必需的，糖代谢中许多酶的活性都与锰有关。
4.2.4 Water：水是培养基的主要成分，其作用是直接参与某些代谢、作为溶剂，并为细胞生长和产物合成提供生理环境。水质对发酵有影响。
4.2.5 生长因子、前体、产物促进剂
（1）生长因子（growth factors）：微生物生长所必需的少量有机化合物，自身不能合成，如氨基酸、嘌呤、维生素；通常由有机氮源提供，如玉米浆。
（2）前体（precursors）：在发酵前或发酵同时加入的物质，它们不发生大的结构变化而被结合进发酵产物分子中，通常用于提高产量或改善产品质量。
前体是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的产量因加入前体而有较大提高。
例：苯乙酸 → 青霉素G；苯氧乙酸 → 青霉素V。
下表列出发酵过程中一些产品所使用的前体物质。
| 产品 | 前体 | 产品 | 前体 |
|---|---|---|---|
| 青霉素G | 苯乙酸 | 核黄素 | 丙酸盐 |
| 青霉素V | 苯氧乙酸 | 类胡萝卜素 | β-紫罗酮 |
| 金霉素 | 氯化物 | L-异亮氨酸 | α-氨基丁酸 |
| 灰黄霉素 | 氯化物 | L-色氨酸 | 邻氨基苯甲酸 |
| 红霉素 | 正丙醇 | L-丝氨酸 | 甘氨酸 |
（3）产物促进剂（product stimulator）：既不是营养物质也不是前体，加入后能提高产物产量的物质。
例：Tween（0.1%）→ 淀粉酶、纤维素酶；大豆酒精提取物 → 纤维素酶。
作用机理尚不十分清楚，可能的原因：
4.3 培养基的设计及优化：培养基设计影响因素多，目前是经验与科学相结合。
4.3.1 培养基成分选择的原则：（1）菌体的同化能力：大分子需经酶水解为小分子才能被利用。
碳源的选择（葡萄糖、淀粉等）需考虑糖化工艺。下表比较三种糖化工艺所得糖液的质量。
| 项目 | 酸法 | 酸酶法 | 双酶法 |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖值（DE值） | 91 | 95 | 98 |
| 葡萄糖含量％ | 86 | 93 | 97 |
| 灰分％ | 1.6 | 0.4 | 0.1 |
| 色度 | 10.0 | 0.3 | 0.2 |
| 羟甲基糠醛％ | 0.309 | 0.008 | 0.003 |
| 葡萄糖收率 | — | 较酸法高5% | 较酸法高10% |
说明：原课件该处数字为粘连串，本表按葡萄糖值、葡萄糖含量、灰分、色度、羟甲基糠醛、葡萄糖收率的项目顺序拆分排列，请对照原图核校。
氮源的选择：如果微生物产生蛋白水解酶，可使用豆饼粉等多种粗氮源；如果微生物缺乏蛋白酶，有机氮源应先行水解。处理方法如：豆饼粉＋水＋盐酸，pH1.0、100℃水解生成氨基酸。
（2）代谢物的阻遏和诱导：
下表比较不同碳源对地衣芽孢杆菌细胞量与淀粉酶活力的影响。
| 碳源 | 细胞量（g/l） | 淀粉酶活（U/ml） |
|---|---|---|
| glucose | 4.2 | 0 |
| Fructose | 4.18 | 0 |
| Sucrose | 4.02 | 0 |
| Dextrin | 3.06 | 38.2 |
| starch | 3.09 | 40.2 |
说明：原课件该处数字为粘连串，本表按细胞量（g/l）与淀粉酶活（U/ml）两项指标对应排列，请对照原图核校。
（3）合适的C、N比：碳氮比对微生物生长和产物合成有很大影响，一般工业发酵培养基的C、N比为100 :（0.2~2.0），最适比例受多种因素影响。
此外还需考虑菌龄，以及氮源对某些产物的诱导与抑制作用。
（4）pH的要求：pH是重要的环境因素，培养过程中pH会发生波动，最优的培养基配方是避免pH波动的关键因素。除考虑营养需求，也要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲的贡献，使pH处于较适宜的状态。
4.3.2 培养基的优化：最佳培养基配方由试验决定。一般程序：
优良工业培养基的判据：
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