页数：109页文件大小：1.79 MB来源： 酶工程ppt课件
本课件为酶工程课程第四章，先归纳有机相酶反应在疏水性底物、热稳定性、反应平衡与避免副反应等方面的十大优点，讲清必需水含量、热力学水活度与酶、溶剂及反应体系的选择原则；继而分析超临界流体、仿水溶剂与分子印迹等研究进展，阐明明有机介质对酶稳定性、活性、专一性与反应平衡方向的影响；最后以手性药物拆分、手性高分子与导电发光聚合物、食品添加剂、多肽合成、甾体转化和生物能源等实例收束。
第四章 有机介质中的酶反应
第一节 有机介质中的酶促反应概述
一．有机相酶反应的优点（1-5）
一．有机相酶反应的优点（6-10）
二．有机相酶反应具备条件
三．有机相酶反应的研究进展
超临界流体的有关性质（1）P-V-T性质
| 流体名称 | 乙烷 | 丙烷 | 丁烷 | 戊烷 | 乙烯 | 氨 | CO2 | 二氧化硫 | 水 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 临界温度（℃） | 32.3 | 96.9 | 150.0 | 296.7 | 9.9 | 132.4 | 31.1 | 157.6 | 374.3 |
| 临界压力（MPa） | 4.87 | 4.25 | 3.80 | 3.37 | 5.04 | 11.28 | 7.38 | 7.88 | 22.11 |
| 临界密度（g/cm3） | 0.203 | 0.220 | 0.228 | 0.232 | 0.227 | 0.236 | 0.460 | 0.525 | 0.326 |
注：源文件临界压力与临界密度两行数据整体错位一格（如把水的 22.11 MPa 误置于二氧化硫列），此处按常用手册值回正；临界温度沿用源文件数值。
超临界流体的有关性质（2）：所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1 ℃，临界压力7.38 MPa）时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。
注：源文件该处临界压力记作 7.28 MPa，与常用手册值及本课件前一页表格的 7.38 MPa 不一致，此处按 7.38 MPa 修正。
超临界流体的有关性质（3）：提高溶剂选择性的基本原则
超临界流体萃取的应用实例
| 工业类别 | 应用实例 |
|---|---|
| 医药工业 | （1）原料药的浓缩、精制和脱溶剂（抗生素等）；（2）酵母、菌体生成物的萃取（γ-亚麻酸、酒精等）；（3）酶、维生素等的精制、回收；（4）从动植物中萃取有效药物成分（生物碱、维生素E、芳香油等）；（5）脂质混合物的分离精制（甘油酯、脂肪酸、卵磷脂） |
| 食品工业 | （1）植物油的萃取（大豆、棕榈、花生、咖啡）；（2）动物油的萃取（鱼油、肝油）；（3）食品的脱脂（马铃薯片、无脂淀粉、油炸食品）；（4）从茶、咖啡中脱除咖啡因，啤酒花的萃取；（5）香料的萃取；（6）植物色素的萃取；（7）油脂的脱色脱臭 |
| 化妆品香料工业 | （1）天然香料的萃取，合成香料的分离、精制；（2）烟草脱烟碱；（3）化妆品原料的萃取、精制（界面活性剂、单甘酯等） |
2．仿水溶剂和印迹技术
极性添加剂对体系的影响
应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基甲酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。
（2）分子印迹技术 例1：当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍；但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。
分子印迹技术原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。酶蛋白分子在有机相中具有对配体的「记忆」功能。
第一节结束（内容小结）
第一节结束，点击返回。
第二节 有机介质中酶促反应的条件
一．必需水（图示）：本页主体为必需水分布示意，水层厚度与结合位点建议对照原图补充。
2．干燥的酶水合过程
3．影响酶反应体系中需水量的因素
胰脂肪酶活性与含水量的关系：本页主体为活性—含水量关系曲线，最适含水量与峰值建议对照原图补充。
二 酶的选择：1 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。
2．酶形式的选择（1）酶粉：例如，有人研究α-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。
（3）固定化酶（图示）：本页主体为有机相中固定化酶示意，载体种类与结合方式建议对照原图补充。
有机相中固定化后载体对酶的影响
三．溶剂及反应体系的选择
1．酶促反应有机介质体系
在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂 AOT（Aerosol OT），其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。
概念
反胶束体系的制备（示意图）：本页主体为反胶束形成过程图示，具体条件建议对照原图补充。
影响因素：反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。
「水壳」模型：水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。
D．影响的主要因素
构建双水相体系实现在线产物分离（Aqueous Two-Phase System, ATPS）：上相富集底物与产物，下相富集副产物与生物催化剂（本页主体为两相分配示意，具体相组成建议对照原图补充）。
双水相体系将头孢立新得率提高3倍，相关文献：Biochemical Engineering Journal, 2002, 11(2-3): 95-100；J. Microbiology and Biotechnology, 2004, 14(1): 62-67。
双相体系与水相体系中产物纯度的比较：双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取，促进了酶反应的平衡，使得L-型底物的转化率为99.95%，而这样得到的D-叔亮氨酸的纯度也提高到99.5%。
2．有机溶剂影响酶催化的方式（1）有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活：
2．有机溶剂影响酶催化的方式（续）
3．选择有机溶剂必须考虑因素
相容性举例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的、与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）。
(2) 溶剂必须对于该主反应是惰性的制剂。例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯；如果溶剂是醇，也会得到类似结果。
(3) 必须考虑的其他因素：溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）。
生物催化剂的环境调控技术：通过「环境调控」技术，实现生物催化剂活性、选择性的人为控制。生物催化剂环境的改变，会导致酶的结构构象的改变，进而使酶的活性、选择性改变。
四．pH选择和离子强度的影响：（1）pH选择：在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。
氧化葡萄糖杆菌催化制备二羟基丙酮（DHA）：二羟基丙酮广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一个重要的化学合成中间体。本页给出工业上以二羟基丙酮作中间体的代表性示例（资料来源：Merck KGaA, Darmstadt, Germany）。
环境pH的改变导致酶的选择性的改变：Tetrahedron: Asymmetry, 2004, 15(8): 1275-1277；氧化葡萄糖杆菌催化D-乳酸转化（本页主体为反应示意，具体底物与产物建议对照原图补充）。
山梨醇改变水活度，改变底物的离子化程度：头孢氨苄合成中助溶剂的影响（本页主体为数据图示，具体收率与条件建议对照原图补充）。
（2）离子强度影响：随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。
第二节结束（内容小结）
第二节结束，点击返回。
第三节 有机介质对酶性质的影响
一、稳定性
一、稳定性（图示）：本页主体为稳定性比较图示，具体数据建议对照原图补充。
结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后，酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。
二 活性：刚-柔并存
图1.5 苯乙酸复合物模型中活性位点示意图（Jing, H. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2000, 11: 45-53）：以球棍模型显示苯乙酸配体，结合位点中的关键残基高亮标出，网格为以1 Å半径探针计算的蛋白质溶剂可及表面。源文件注明「无法显示该图片」，具体结构建议对照原课件补充。
图1.6 PGSO结合活性位点的电子云密度图：Stereoview of the electron density map of PGSO bound in the active site of WT-PGSO（Ren, L.G. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2002, 18: 3-11）。本页主体为电子密度图，具体残基与配体密度建议对照原图补充。
酶活性丧失的可能原因：本页主体为原因归纳图示，具体条目建议对照原图补充。
二、活性：1、单相共溶剂体系中有机溶剂对酶活性影响
2、低水有机溶剂体系中的酶活性：大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化。例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙醇脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化。
根据
超活性产生机理：本页主体为机理示意图，具体模型建议对照原图补充。
三、专一性：某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。
四、反应平衡方向
| 酶 | 合成产物 | 有机溶剂 | 使用浓度（%） | 合成收率（%） |
|---|---|---|---|---|
| 枯草杆菌蛋白酶 | 核糖核酸酶 | 甘油 | 90 | 50 |
| 无色杆菌蛋白酶 | 人胰岛素 | DMF和乙醇 | 30 | 80 |
| 羧肽酶 | 牛胰核糖核酸酶 | 甘油 | 90 | 50 |
| 凝血酶 | 人生长激素 | 甘油 | 80 | 20 |
| 嗜热杆菌蛋白酶 | 天冬甜味素 | 乙酸乙酯 | — | — |
| 胰凝乳蛋白酶 | 脑啡肽 | 乙醇或DMF | — | — |
注：源文件未给出嗜热杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶两行的使用浓度与合成收率，此处留空待对照原图补充。
第三节结束（内容小结）
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第四节 有机介质中酶催化的应用
| 酶 | 催化反应 | 应用 |
|---|---|---|
| 蛋白酶 | 肽合成 | 合成多肽 |
| 蛋白酶 | 酰基化 | 糖类酰基化 |
| 羟基化酶 | 氧化 | 甾体转化 |
| 过氧化物酶 | 聚合 | 酚类、胺类化合物的聚合 |
| 胆固醇氧化酶 | 氧化 | 胆固醇测定 |
| 醇脱氢酶 | 酯化 | 有机硅醇的酯化 |
| 酶 | 催化反应 | 应用 |
|---|---|---|
| 脂肪酶 | 肽合成 | 青霉素G前体肽合成 |
| 脂肪酶 | 酯合成 | 醇与有机酸合成酯类 |
| 脂肪酶 | 转酯 | 各类酯类生产 |
| 脂肪酶 | 聚合 | 二酯的选择性聚合 |
| 脂肪酶 | 酰基化 | 甘醇的酰基化 |
注：源文件本页仅在第一行标注酶名为脂肪酶，其余各行沿用该酶。
有机介质中酶催化的应用
有机介质中酶催化的应用
一．手性药物的拆分
1 手性药物两种对映体的药效差异
2．手性药物的拆分方法：分为非生物法、生物法。
生物拆分法
生物拆分法
对映体过量值（e.e.）：分别给出残余底物与生成产物的计算式（源文件公式未提取到文字，具体表达式建议对照原图补充）。
一般认为比旋光度与组成之间成直线关系，因此在实验无误差时，o.p.与e.e.所表示的数值应是相同的。
青霉素酰化酶及其催化作用：利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。TW Wang, DZ Wei* et al., Structure-Based Stabilization of an Enzyme: The Case of Penicillin Acylase from Alcaligenes faecalis, Protein & Peptide Letters, 2006 (In press).
青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分，相关文献：Shu-Lai Liu, Dongzhi Wei* et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006 (In press)；Shu-Lai Liu, Dongzhi Wei* et al., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2006 (In press).
水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分：消除副产物苯乙酸的抑制（青霉素酰化酶在氨基酸拆分中的应用）。本页主体为反应与分离示意，具体转化率建议对照原图补充。
氧化葡萄糖杆菌高效催化合成米格列醇关键中间产物：（1）（2）（3）三步关键中间体，关键：生物催化效率及反应专一性。氧化葡萄糖杆菌用于II型糖尿病首选药物——米格列醇的生物合成（本页主体为合成路线图，具体结构建议对照原图补充）。
氧化葡萄糖杆菌催化制备D型乳酸（全新反应），相关文献：W Su, DZ Wei* et al., Tetrahedron: Asymmetry, 2004, 15(8): 1275-1277；GK Gao, DZ Wei* et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, Online first.
二 手性高分子聚合物的制备
六 食品添加剂的生产：利用芳香醛脱氢酶生成香兰素（本页主体为反应路线，具体底物建议对照原图补充）。
七 多肽的合成：α-胰蛋白酶可以催化N-乙酰色氨酸与亮氨酸合成二肽；水中反应合成率为0.1%以下；在乙酸乙酯和微量水组成的系统中，合成率可达100%。
八 甾体转化：可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%和90%。
九 生物能源
第四节结束（内容小结）
第四节结束，点击返回。
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