第1页：考试6：杀菌机理与计数法
考试6
- 1.X、γ射线的杀菌机理是什么？
- 2.氧化剂的杀菌机理是什么？
- 3.福尔马林的主要成分是什么？
- 4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓度是多少？
- 5.青霉素的抗菌机理是什么？
- 6.直接计数法的特点是什么？有哪些具体方法？
第2页：比浊计数法
- 4．比浊计数法
- 浊——细菌悬浮液的浊度
- 细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比
第3页：制标准曲线（OD~No）
- （1）制标准曲线（OD~No）
- （2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量浊度仪或721分光光度仪
第4页：（二）间接计数法(活菌计数法)
（二）间接计数法(活菌计数法)
- 提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？
- 繁殖
- 提问：细菌繁殖的可见现象是什么？
- 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）
- 计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.
- 缺点：慢
分固体培养法和液体培养法
第5页：平板计数的稀释操作
- 无菌水
- 1.稀释平板计数法—固体培养法第一步：菌样巧妙稀释得到不同稀释度（10-x）菌液菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图
第6页：平板涂布的稀释度选择
10-210-3 10-410-5各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落
第7页：适宜计数的菌落数范围
- 一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。
- 第四步：计数
- 细菌数量=？
- 细菌数量=数出的菌落数/稀释度
- 例如：10-5稀释度时菌落数为125个
- 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL
- 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
- 如国标法水中细菌总数的测定。
- 注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差平均
第8页：稀释液体计数法
- 2.稀释液体计数法
- 特点：液体培养、统计学查表计数
- 又称MPN法（或最可能数法）
- MostProbableNumber
- 例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量
- 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？
- 一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱）
- 对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。
第9页：MPN法的稀释与接种
33 2 010 -410-510-63 10-10-210-3 10-410-5（1）稀释（2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，恒温37℃培养14天记录变黑的试管情况（3）培养1ml+9ml培养基
- 提问：为什么有些试管变黑有些没有？
- 稀释程度、取样概率
第10页：统计－查表－计算
MPN 三管法测数统计表：原页为图片表格，源文件未提取到表格数据，建议对照原图补充完整表格内容。
第11页：MPN三管法查表计算
MPN 三管法查表示例
MPN 三管法查表示例| 项目 | 数值 |
|---|
| 数量指标 | 320 |
|---|
| 细菌最可能数 | 9.5 个菌/毫升 |
|---|
| 最低稀释度 | 10-4 |
|---|
示例样品折算菌浓度＝最可能数 ÷ 最低稀释度。水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用此法统计。
第12页：薄膜计数法
- 3.薄膜计数法
- 薄膜——微孔滤膜（φ0.45um）（2）滤膜培养膜有菌面冲上
- 原理——膜抽滤（细菌浓缩）+膜平板培养+计数（1）抽滤（滤器及膜事先灭菌）
第13页：薄膜计数法的统计
（3）统计计数
- 提问：假如测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？
- 250÷50ml=5个/ml自来水
- 样品中的细菌数量=菌落数÷抽滤样品的体积数
- 要求——样品洁净
如空气或饮用水。
- ？
- 堵孔、菌太多难以分散
- 提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？
- 减少滤液体积、无菌水稀释
第14页：(三)重量法
(三)重量法
- 提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？
- 已知单个细菌的平均重量除法计算
- 细菌的湿重量＝10-15~10-11g/个细胞
- 干重约为湿重的10％~20％。
- 1.干重法
- 方法：含菌水样在105～110℃下进行干燥恒重（本质测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。
第15页：悬浮物＝无机物+有机物（包括细菌）
悬浮物＝无机物+有机物（包括细菌）
- 提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？
- 高温(550℃)灼烧
- 无机物化学性质稳定，高温下不会分解
- 提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？
- 悬浮物中绝大多数是细菌。
第16页：悬浮物中绝大多数为细菌时
- （1）悬浮物中绝大多数为细菌时
- 细胞数目=MLSS÷个体细菌的平均干重量离心沉淀滤膜过滤计算105~110℃下进行干燥恒重称重或MLSS悬浮物
第17页：除细菌外还有大量无机悬浮物时
- （2）除细菌外还有大量无机悬浮物时
- W无
- MLVSS挥发性悬浮物＝MLSS－W无=细菌群体的干重量
- 细胞数目=MLVSS÷个体细菌的平均干重量550℃下灼烧2h称重105~110℃下进行干燥恒重称重MLSS
第18页：有大量非细菌有机悬浮物时
（3）有大量非细菌有机悬浮物时
- 提问：如何测定呢？
- 不能用重量法
第19页：细胞含N量法
- 2.细胞含N量法
- 大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般为蛋白质干重15％~16％，平均为16％。
- ＊还需要测定哪些条件可以由以上比例确定菌样中细菌浓度？如何试验操作及计算呢？
- （答案见课件图示）
第20页：DNA含量法
- 3.DNA含量法
- 同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量
- 少量纯细菌培养时细菌数量的测定。
- 精确性非常高，对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，
第21页：劳伦斯方程与符号含义
劳伦斯方程符号含义
劳伦斯方程符号含义| 符号 | 含义 |
|---|
| v | 总污染物微生物利用速度 |
|---|
| V | 最大速度 |
|---|
| X | 微生物浓度 |
|---|
| Ks | 饱和常数 |
|---|
第22页：计数方法的选择依据
提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该如何选择方法？视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取
第23页：细菌生长的阶段类比
- “生、老、病、死”
- （根据投食方式）分间歇式培养（分批培养）、连续式培养两种情况
- 1.间歇培养
- 提问：如何人工进行细菌间歇培养？
- 只有开始时的一次性投料和接种细菌（其余时间细菌根据环境变化自行生灭）二、细菌的生长特性（“坐吃山空型”）应用：生理特性研究、生物发酵和生物治污
第24页：活细菌重量变化曲线
（1）活细菌重量变化曲线曲线：群体重量W(mg/l)——时间t细菌内源呼吸增长率上升阶段及细菌大量死亡阶段mg/L活细菌重量t0 时间曲线t`点切线斜率值=?t`重量增长速率t`增长率下降阶段生长情况用活细菌生长曲线来描述
第25页：①增长速率上升阶段
①增长速率上升阶段
- 提问：为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？
- A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大增长率生上升阶段mg/mL0 时间t活细胞重量
第26页：②增长速率下降阶段
②增长速率下降阶段
- 提问：为什么增长速率较前下降了？增长率下降阶段mg/mL0 时间t活细胞重量
- 营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
- 这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止
- 代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制
第27页：③内源呼吸及死亡阶段
- ③内源呼吸及死亡阶段
- ———内源呼吸+毒物浓度更高
- （个体）瘦→死
- （群体）死亡率大于出生率
- 从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。
- 提问：此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？
- 不是，利用死亡细菌的残体营养(“化做红泥更护花或人吃人”)
- 各种生物具有类似的规律
- 实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线，虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。
