12 第九章 复制.ppt

第1页：DNA的生物合成(复制)DNA

DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis（Replication）第九章

第2页：中心法则（Central Dogma）

中心法则（Central Dogma）

第3页：复制(replication)是指遗传物

复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。

复制亲代DNA子代DNA

第4页：子链继承母链遗传信息的几种可能方式全保留

•子链继承母链遗传信息的几种可能方式全保留式半保留式混合式

第5页：一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物

• 一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。
• 半保留复制的概念

第6页：AGGTACTGCCACTGGTCCAT

AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA目录

第7页：密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的

•密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。

含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果

第8页：按半保留复制方式

• 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的核苷酸序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。
• 半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

第9页：参与DNA复制的物质底物(substra

•参与DNA复制的物质底物(substrate):dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template) :解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3 -OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子

第10页：二、参与DNA复制的主要酶类与蛋白因子

• 二、参与DNA复制的主要酶类与蛋白因子
• （一）原核生物
• 1拓扑异构酶（topoisomerase）DNA拓扑异构酶主要有Ⅰ和Ⅱ两种类型。
• 拓扑异构酶作用特点–既能水解、又能连接磷酸二酯键

第11页：解链过程中正超螺旋的形成

解链过程中正超螺旋的形成目录

第12页：拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶

拓扑异构酶是一类可改变DNA拓扑性质的酶。

在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生正超螺旋，拓扑异构酶可松弛正超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。

在复制完成后，拓扑异构酶又将DNA分子引入负超螺旋，有利于DNA缠绕、折叠、压缩以形成染色质。

第13页：Ⅰ型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现

Ⅰ型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，称为拓扑异构酶Ⅰ，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。

另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。

第14页：Ⅱ型拓扑异构酶又称为旋转酶（gyrase

Ⅱ型拓扑异构酶又称为旋转酶（gyrase），由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。

它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。

第15页：Ⅱ型拓扑异构酶又称为旋转酶（gy（续）

目录

第16页：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链

• 拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。
• 作用机制

第17页：解旋酶（helicase）也称为解链酶

2解旋酶（helicase）也称为解链酶，解旋酶解开DNA双链，但需要ATP水解供能，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。

在原核生物中，解旋酶不止有一种。

这说明不仅在复制过程中需要DNA解旋酶，在许多其它的过程，如转录、DNA修复、DNA重组中也同样需要。

第18页：单链DNA结合蛋白（single

3单链DNA结合蛋白（single strand bindingprotein, SSB protein）大肠杆菌的SSB蛋白由4个相同亚基构成，其功能在于稳定解开的DNA单链，阻止DNA复性和保护单链部分不被核酸酶降解。

原核生物的SSB蛋白与DNA的结合表现出明显的协同效应，SSB蛋白可以重复利用。

第19页：引发酶（primase）又称引物合成酶

4引发酶（primase）又称引物合成酶，是一条分子量约为60ku的单肽链，每个细胞约有50-100个分子，该酶单独存在时相当不活泼，只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，这种复合体称为引发体（primosome）。

合成的引物是长约5-10个核苷酸的RNA。

一旦RNA引物合成，就可以由DNA聚合酶Ⅲ在它的3′-OH上继续催化DNA新链的合成。

第20页：DNA聚合酶是以DNA为模板

DNA聚合酶是以DNA为模板，催化底物（dNTP）合成DNA的酶类，普遍存在于生物体内。

它们的作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物，在DNA模板指导下，催化底物加到引物的3′-OH上，形成3′，5′磷酸二酯键，由5′→3′方向延长DNA链。

引物是DNA合成所必需的。

5 DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（DNA polymeraseⅠ、Ⅱ、Ⅲ）

第21页：

第22页：DNA聚合酶Ⅰ的功能如下

DNA聚合酶Ⅰ的功能如下：①5′→3′聚合酶活性，当底物和模板存在时，DNA聚合酶Ⅰ可使脱氧核糖核苷酸逐个加到引物的3′-OH末端的多核苷酸链上。

②5′→3′外切酶活性，它可以及时切除复制起始合成的RNA引物；③3′→5′外切酶活性，起校对功能，它可切除聚合上去的错误的核苷酸，从而可使复制的忠实性提高1000倍。

第23页：DNA双链的碱基互补配对

• 5´A G C T T C A G G A T A 3´| | | | | | | | | | |3´T C G A A G T C C T A G C G A C 5´
• 3 5 外切酶活性
• 5 3 外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。
• 核酸外切酶活性目录

第24页：DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段

• 323个氨基酸（35ku)小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸(68ku)DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-pol Ⅰ
• Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

第25页：DNA聚合酶Ⅱ为多亚基酶

DNA聚合酶Ⅱ为多亚基酶，由分子量约为88ku的多肽链组成，DNA聚合酶Ⅱ除具有5′→3′聚合酶活性外，也有3′→5′核酸外切酶活性，但无5′→3′外切酶活性。

它也只是修复酶，而非真正的复制酶。

第26页：DNA聚合酶Ⅲ被认为是真正的DNA复制酶

DNA聚合酶Ⅲ被认为是真正的DNA复制酶(replicase)，全酶由α、β、γ、ε、θ、τ、ψ、χ、δ、δ`等10种亚基组成，也含有锌原子，分子量大约900ku，以二聚体起作用。

α亚基主要有5′→3′聚合活性；ε亚基具有3′→5′核酸外切酶活性；2个β亚基充当“滑动夹子”，它通过γ复合物夹子载体组装到DNA上，此步骤需要ATP。

2个β亚基围绕双螺旋形成一个环，以利于聚合酶沿着模板滑动。

第27页：功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的

功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-pol Ⅲ

第28页：正是由于DNA聚合酶Ⅲ的组成复杂

正是由于DNA聚合酶Ⅲ的组成复杂，使它具有了强催化活性、忠实性、持续性。

DNA聚合酶Ⅲ可连续催化几千个磷酸二酯键的形成。

所以它催化的合成速度达到了体内DNA合成的速度。

它还有3′→5′核酸外切酶活性，使得复制的忠实性由7╳10-6提高至5╳10-9，但DNA聚合酶Ⅲ无5′→3′外切活性。

第29页：大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较DNA

大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅰ≥10≥71不同种类亚基数目900 ku88 ku103 ku相对分子质量+++5´→3´核酸聚合酶活性+++3´→5´核酸外切酶活性--+5´→3´核酸外切酶活性15 000~60 00024001 000~1200聚合速度（核苷酸/分）≥500 00015003~200持续合成能力10~20100400分子数/细胞复制修复切除引物，修复功能

第30页：DNA连接酶的作用

6 DNA连接酶（DNA ligase）大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量约为74ku的多肽，每个大肠杆菌细胞含有约300个连接酶分子。

它催化双链DNA切口处的5′-磷酸基和3′-羟基生成磷酸二酯键，反应需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）提供能量，并释放出烟酰胺单核苷酸（NMN）。

在真核生物中则需要ATP。

DNA连接酶在DNA的复制、修复和重组等过程中均起重要作用。

第31页：

第32页：（二）真核生物1拓扑异构酶（topois

（二）真核生物1拓扑异构酶（topoisomerase）真核生物的拓扑异构酶Ⅰ是分子量约为95ku的单体蛋白。

虽然它所催化的反应与原核生物的酶相似，但它同样能使正、负超螺旋DNA松弛。

松弛作用不依赖于ATP，能发生于有EDTA存在的条件下，Mg2+能提高该酶的活力。

第33页：拓扑异构酶Ⅱ为150ku-180ku的均

拓扑异构酶Ⅱ为150ku-180ku的均二聚体，能以同样的速率松弛正、负超螺旋DNA；与原核生物不同的是，真核生物拓扑异构酶Ⅱ不能产生负超螺旋，发挥作用时需要ATP和Mg2+。

第34页：DNA聚合酶的结构与功能

2 DNA聚合酶（DNA polymerase）DNA-pol 为多亚基酶，其中一个亚基具有引物合成酶活性，最大的亚基具有聚合酶活性，无外切酶活性的亚基。

DNA-pol 既有持续合成DNA链的能力，又有校正功能，由它完成DNA的复制。

DNA-pol 可能相当于细菌的DNA聚合酶Ⅰ，它是一种修复酶，参与DNA的修复合成，并存在于复制叉处，用以取代滞后链冈崎片段的引物。

DNA-pol 也是修复酶。

DNA-pol 是线粒体DNA的合成酶。

第35页：真核生物的DNA聚合酶

真核生物的DNA聚合酶

第36页：复制蛋白A（replication

3复制蛋白A（replication protein A，RP-A）是真核生物的单链DNA结合蛋白，其作用类似于大肠杆菌的SSB蛋白。

4复制因子C（replication factor C，RF-C）RF-C是夹子装置，相当于大肠杆菌的γ复合物，它控制滞后链上酶的结合与脱离。

第37页：原核生物复制时

原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。

三、双向复制复制中的放射自显影图象

第38页：A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中

A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C

第39页：真核生物每个染色体有多个起始点

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。

习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。

复制子是独立完成复制的功能单位。

第40页：复制子与复制起点示意

5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’

第41页：四、复制的半不连续性3 5 3 5 解链

四、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向3´5´3´3´5´前导链(leading strand)滞后链(lagging strand)

第42页：顺着解链方向生成的子链

• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为滞后链。复制中的不连续片段称为冈崎片段(okazakifragment)。
• 前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性。

第43页：复制的化学反应(dNMP)n+dNTP

复制的化学反应(dNMP)n+dNTP → (dNMP)n+1+PPi目录

第44页：聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板

•聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 →3 方向进行。

第45页：（一）复制的起始需要解决两个问题

（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。

2.合成引物，提供3 -OH末端。

五、原核生物的DNA生物合成

第46页：Dna ADna B

Dna ADna B、Dna CDNA拓扑异构酶引发酶SSB3 5 3 5 引发体和引物含有解螺旋酶、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

第47页：引物由引发酶催化合成

3 5 3 5 引物是由引发酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引发酶

第48页：（二）复制的延长复制的延长指在DNA-p

（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

第49页：DNA聚合酶延伸的dNTP排列

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 3'3'DNA-pol目录

第50页：前导链的合成

前导链的合成目录

第51页：滞后链的合成

滞后链的合成目录

第52页：滞后链的合成（续）

目录

第53页：复制的起始阶段示意（阶段一、二）

阶段一阶段二

第54页：复制的延长阶段示意（阶段三、四）

阶段三阶段四

第55页：复制过程简图

复制过程简图目录

第56页：原核生物基因是环状DNA

•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。

oriterE.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止

第57页：滞后链冈崎片段的连接

• 5 5 5 RNA酶OHP5 DNA-pol ⅠdNTP5 5 PATPADP+Pi5 5 DNA连接酶
• 滞后链上不连续性片段的连接

第58页：滞后链冈崎片段的连接（续）

目录

第59页：哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2S

• 哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM（二）真核生物的DNA生物合成
• 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。
• 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

第60页：端粒(telomere)指真核生物染色体

• 端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能
• 维持染色体的稳定性
• 维持DNA复制的完整性结构特点
• 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。
• 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…

第61页：端粒酶（telomerase）端粒（te

端粒酶（telomerase）端粒（telomere）是真核生物线性染色体末端的特殊结构，它由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人为TTAGGG，四膜虫为TTGGGG）。

端粒的功能为稳定染色体的末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5′-末端在消除RNA引物后造成的空缺。

复制可使端粒5′末端缩短，而端粒酶可外加重复单位到5′-末端上，结果使端粒维持一定的长度。

第62页：真核生物的端粒酶是一种含有RNA链的逆转

真核生物的端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以自身所含的RNA为模板来合成DNA的端粒结构。

通常端粒酶是含约150个核苷酸的RNA链，其中含1.5个拷贝的端粒重复单位的模板。

端粒酶可结合到端粒的3′末端上，每次都是RNA模板的5′末端碱基（CCCCAACCCCAA）识别DNA的3′末端碱基（TTGGGGTTGGGG）并相互配对，以RNA链为模板使DNA链延伸，合成一个重复单位后酶再向前移动一个单位。

端粒的3′单链末端可回折作为引物，合成其互补链。

第63页：端粒酶RNA (human

• 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)
• 端粒酶协同蛋白(human telomerase associatedprotein 1, hTP1)
• 端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase, hTRT)组成

第64页：引物酶与引发体形成示意

四膜虫的端粒酶指导的DNA合成过程

第65页：端粒酶的催化延长作用爬行模型

端粒酶的催化延长作用爬行模型目录

第66页：DNA聚合酶复制子链进一步加工

DNA聚合酶复制子链进一步加工目录

第67页：Fidelity

Fidelity:1a the quality or state of being faithful.1b accuracy in details: exactness2 the degree to which an electronic device (as a record,player, radio or television) accurately reproduces iteffect (as sound or picture)Synonyms:Allegiance/fealty/loyalty/devotion/piety

第68页：Fidelityimplies

Fidelityimplies strict and continuing faithfulnessto a obligation, trust, or duty.Allegiancesuggests an adherence like that of acitizen to his country.Fealtyimplies a fidelity acknowledge by theindividual and as compelling as a sworn vow.Loyaltyimplies a faithfulness that is steadfast inthe face of any temptation to renounce, desert, orbetray.Devotionstresses zeal and service amounting toself-dedication.Pietystresses fidelity to obligation regarded asnatural and fundamental.

第69页：遵守严格的碱基配对规律

1.遵守严格的碱基配对规律；2.复制出错时DNA-pol的及时校读功能；3.复制时需要引物；4.按照5’——3’方向合成；5.修复系统的作用DNA复制的保真性至少要依赖5种机制

第70页：逆转录酶(reverse

逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录(reverse transcription)RNADNA逆转录酶六、其他类型的复制（一）逆转录病毒和逆转录酶

第71页：逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆

逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA

第72页：逆转录研究的意义

• 逆转录研究的意义
• 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。
• 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。
• 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

第73页：（二）滚环复制W. Gilbert和D.

（二）滚环复制W. Gilbert和D. Dressler于1968年提出噬菌体Φx174 DNA

第74页：（三）取代环复制线粒体DNA

（三）取代环复制线粒体DNA

第75页：七、DNA的损伤与修复物理因素

七、DNA的损伤与修复物理因素：紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射UV

第76页：引起DNA损伤的化学因素

化学因素：目录

第77页：镰形红细胞贫血病人Hb

镰形红细胞贫血病人Hb (HbS)β亚基N-val·his·leu·thr·pro·val·glu······C肽链CACGTG基因正常成人Hb (HbA)β亚基N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu······C肽链CTCGAG基因

第78页：DNA损伤的修复修复(repairing

• DNA损伤的修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其恢复为原有的天然状态。
• 光修复(light repairing)
• 切除修复(excision repairing)
• 重组修复(recombination repairing)
• SOS修复修复的主要类型

第79页：（一）光修复光修复酶(photolyas

（一）光修复光修复酶(photolyase)UV

第80页：UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合

UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP（二）切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。

DNA连接酶ATPE.coli的切除修复机制目录

第81页：（三）重组修复

（三）重组修复

第82页：（四）SOS修复

• （四）SOS修复
• 当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。
• 在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。
• 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。

第83页：ReplicationNucleosid

ReplicationNucleosideNucleotideAdenineThymineGuanineCytosineUracilXanthineHypoxanthineDouble helixGrooveTemplatePrimerPrimosomePolymeraseComplementaryFidelitySemiconservative replicationSemicontinuous replicationExonucleaseEndonucleaseHelicaseOrthophosphatePyrophosphateTopoisomeraseProkaryoteEukaryoteTelomereTelomerase