18 第二部分.ppt

第1页：预备知识第二节

• 预备知识第二节DNA的生物合成和修复第三节RNA的生物合成和加工
• 节小结第十三章核酸的代谢

第2页：基因(gene)----

• 基因(gene)----生命体遗传信息的传递体,是编码生物活性产物(蛋白质或各种RNA)的DNA功能片段,其功能的体现遵循中心法则
• 原核生物:每个细胞只有一个染色体.
• 真核生物:每个细胞含有多条染色体.
• 染色体以外的遗传因子:包括细菌的质粒,病毒,真核细胞的细胞器中DNA等
• DNA的体外复制:分子克隆

第3页：遗传中心法则“复制”“翻译”逆转录

• 遗传中心法则“复制”“翻译”逆转录RNA的复制1958年,F.Crick提出中心法则:复制、转录、翻译中心法则的补充:逆转录、RNA的复制。“转录”

第4页：DNA的双螺旋结构

• DNA的双螺旋结构

第5页：第二节DNA的生物合成与

• DNA的复制特点
• 半保留复制(self-conservative replication)
• 复制子(Replicon)含起始、终止和方向
• 半不连续复制
• 复制的保真性

第6页：半保留复制

• (一)半保留复制

第7页：DNA的半保留复制的证明

• 1958年,Meselson和Stahl用普通培养基(14N)培养15N标记的大肠杆菌。用CsCl密度梯度离心法分析子代和二代DNA而推知。第一代第二代细菌(含15N-DNA)普通DNA普通DNA重DNA 重DNA普通培养基普通培养基密度梯度离心

第8页：λ1963年由

• λ1963年由Cairns用3H标记大肠杆菌DNA经过两代之后,用溶菌酶把细胞壁消化掉,使完整的染色体DNA释放出来,铺在一张透析膜上,用感光乳胶片感光,显影后在电子显微镜下观察。DNA的半保留复制的证明

第9页：复制子•复制子:基因组中能单独进行复制的

• (二)复制子
• 复制子:基因组中能单独进行复制的单位。每个起始点到终止点的区域为一个复制子。单复制子:一般原核生物细胞多复制子:真核生物细胞核DNA。各复制子长度一般在200~300bp ;各复制子发动复制的时间有先有后
• 起始点(origin of replication, ori):原核生物DNA分子中只有一个,长度约200bp(大肠杆菌ori C有245 bp)。真核生物有多个复制起点
• 终止点( terminate of replication, ter):D、A、C、B(23bp共有序列)Tus(terminator utilization substance)识别终止序列
• 复制的方向:单向或双向
• 复制叉

第10页：起始点:复制方向:复制叉(生长点)复制叉

• 起始点:复制方向:复制叉(生长点)复制叉(生长点)单向复制双向复制细菌复制叉移动速度50000bp/min真核生物复制叉移动速度3000bp/min

第11页：DNA的聚合反应和有关的酶

• (三)DNA的聚合反应和有关的酶DNA复制体系
• 底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
• 模板单链的DNA母链
• 引物寡核苷酸引物(RNA)
• 其他酶和蛋白质因子DNA聚合酶(DNA依赖的DNA的聚合酶)引物酶或RNA聚合酶(引发酶)解螺旋酶DNA旋转酶(拓扑异构酶)单链DNA结合蛋白(原核SSB、真核RPA}DNA连接酶(ligase) 切除引物的酶

第12页：催化反应特点

• 以4种dNTP为底物
• 反应需要接受DNA模板的指导,不能催化游离的dNTP的聚合
• 反应需有引物3‘-OH的核酸链
• 链生长方向5’ →3‘
• 产物DNA的性质与模板相同
• DNA聚合酶

第13页：λ5′至3′的聚合活性

• λ5′至3′的聚合活性(5′→ 3′ )DNA聚合酶(DNA polymerase)的活性

第14页：核酸外切酶活性3′→5′

• 核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性(校对)5′→3′外切酶活性

第15页：E.coli三种

• E.coli三种DNA聚合酶的性质比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ分子量109KD120KD>600KD每个细胞中的分子数40017-10010-205′→3′聚合活性+++37℃转化率核苷酸数/酶分子·分钟6003030,0005′→3′外切活性+--3′→5′外切活性+++切刻平移活性+--对dNTP亲和力低低高功能修复复制修复去除引物填补空缺DAN聚合酶的种类

第16页：DNA聚合酶Ⅰ

• DNA聚合酶Ⅰ:多功能酶413页酶的指形结构:414页握住核酸分子NC5′→3′外切活性3′→5′外切活性5′→3′聚合活性NC5′→3′外切活性3′→5′外切活性5′→3′聚合活性NCKlenow片段蛋白水解酶胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶作用于双链DNA作用于单链DNA

第17页：DNA聚合酶Ⅲ

• DNA聚合酶Ⅲ:10种亚基组成。以异二聚体形式存在核心酶:α、ε和θ三种亚基组成。β夹子:两个β-亚基构成夹子。夹住模板。416页

第18页：真核生物DNA聚合酶的比较

• 真核生物DNA聚合酶的比较βγδε亚基数44425分子量(KD)>25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性+++++3′→5′外切活性--+++功能复制和引发,与随从链有关修复复制存在于线粒体复制与领头链有关修复α

第19页：复制中DNA双链的解链和

• 解链酶–领头链(先导链)rep蛋白Dna B–随从链(滞后连)解链酶Ⅱ

第20页：DNA拓扑异构酶

• 既能水解,又能连接磷酸二酯键
• 拓扑酶Ⅰ切断DNA双链中的一股
• 拓扑酶Ⅱ切断DNA双链
• 单链DNA结合蛋白(SSB)维持模板处于单链状态保护单链的完整

第21页：引物酶RNA聚合酶Dna

• 引发体Dna A辨认复制启始点,再结合Dna B,Dna C及其他复制因子形成复合体OriginOther InitiationProteinsReplicatorInitiatorInitiatorOriginOther InitiationProteinsReplicator

第22页：DNA连接酶

• 催化两段DNA(冈崎片段/切口)之间的连接

第23页：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

• polⅠ

第24页：DNA的半不连续复制风崎片段前导连引物

• (四)DNA的半不连续复制风崎片段前导连引物RNA
• 冈崎片段1968年冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段,
• 细菌:1Kb-2Kb,相当于一个顺反子的大小
• 真核:100-200bp,约等于一个核小体DNA的长度

第25页：DNA复制过程

• (五)DNA复制过程(起始、延伸、终止)
• 起始阶段
• DNA解成单链
• E.coli复制起始点oric跨度为245bp,包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列.
• 真核细胞染色体比较复杂,有多个复制起点,同时形成多个复制单位.
• 要求DNA呈负超螺旋

第26页：引发体的生成

• 引物酶合成RNA引物(10bp左右)
• 解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA的起始复制区域形成引发体
• DNA聚合酶Ⅲ由其β亚单位辨认引物.
• 拓扑异构酶: 松弛螺旋

第27页：

第28页：复制的延伸

• 复制延长的酶–原核生物为pol Ⅲ–真核生物为DNA 聚合酶α和δ,其中α与随从链的合成有关,δ与领头链的合成有关
• 复制延长的生化过程–原核生物复制延长的速度很快,–真核生物复制有多个复制起点,
• 复制的半不连续性和冈崎片段领头链连续合成,随从链则是不连续合成
• 复制时的延伸速度是相对恒定的

第29页：复制的终止终止子位点停止复制

• 复制的终止终止子位点停止复制,复制体解体,在DNA拓扑异构酶参与作用下,两个DNA分子分开。原核生物复制终止及不连续片段连接–复制有终止点ter–领头链是不间断延长的.
• polⅠ5′→ 3′外切酶活性水解引物
• polⅠ聚合活性填补空隙
• DNA连接酶连接缺口

第30页：环状DNA分子的θ型复制

• 其它环状DNA分子的复制Θ复制

第31页：滚环复制

• 滚环复制

第32页：D环复制

• D环复制(D loop replication):线粒体DNA不形成冈崎片段

第33页：端粒（telomere）

• 端粒(telomere) 真核生物线性染色体DNA分子3’末端的一种特殊结构,和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解;解决染色体复制时末端丢失问题。–富含GC的重复序列–人的DNA端粒含(TTAGGG)n ,长度5~15kb
• 端粒酶(telomerase) RNA--蛋白质复合物,既可做模板,又具有逆转录酶活性。–以自身的RNA为模板延长DNA单链,弥补染色体末端的短缺部分–端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关。真核生物的端粒和端粒酶

第34页：端粒酶（Telomerase）

• Telomerase: 由RNA和蛋白质组成的酶。兼有模板和逆转录酶两方面的作用。λ1995年,Junli Feng等克隆了人类端粒酶RNA基因,长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域(5-CUAACCCUAAC-3)与人的端粒序列(TTAGGG)n互补

第35页：

第36页：端粒与衰老实验

• 端粒与衰老实验:在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时,端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。结论:细胞的衰老是由端粒驱动的。体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短,丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。可把端粒看成一面钟,端粒的长度是钟上的刻度,记载了细胞分裂的次数,称为“端粒钟”,或有丝分裂钟或“生命的时钟”,可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短,具有无限的分裂能力,原因在于端粒酶的存在

第37页：端粒酶与肿瘤

• 人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外,绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性,而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性
• 肿瘤的端粒长度很短,其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡,而端粒酶的激活可以维持端粒的长度,维持肿瘤的继续分裂、增殖
• 端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径
• 端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标
• 可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长,而对正常细胞没有影响

第38页：从模板复制最初几个核酸时

• 从模板复制最初几个核酸时,碱基堆集力和氢键都较弱,易发生错配
• 复制的最初几个核苷酸,没有与模板形成稳定双链,DNA聚合酶的3‘→5校对功能难发挥作用
• 聚合酶对dNTP的选择
• 3‘→5’核酸外切酶活性以及碱基互补配对
• 机体内对DNA损伤的修复
• DNA复制的忠实性
• DNA复制为什么要用RNA引物?426页细菌和真核生物复制体的组成

第39页：二、RNA的逆转录

• RNA的逆转录(致癌RNA病毒)逆转录的一般过程

第40页：逆转录酶

• 逆转录酶(reverse transcriptase, RT)
• 是个多功能酶逆转录活性:RNA指导的DNA聚合酶活性。RNaseH 活性:水解RNA/DNA 杂交体上的RNA。DNA聚合酶活性:DNA指导的DNA聚合酶活性,合成互补DNA没有3`→5`外切酶活性
• 特点:含有Zn2+,5’ →3’方向合成;引物(长度至少4个dNMP或NMP),需适当浓度的二价阳离子(Mg2+、Mn2+)

第41页：逆转录酶

• 逆转录酶(reverse transcriptase)λ1964年,Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明:RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA
• Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制,但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明:转录对于RNA病毒增殖是必需的
• Temin提出前病毒假说:原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。λ1970年,Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶

第42页：试管内cDNA的合成

• cDNA: 合成出的相应于一定mRNA的互补DNA。可代表某一特定基因
• 常用于获得或研究真核生物基因的方法
• 常用的逆转录酶有两种:来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT;来自鼠白血病毒称为MMLV-RT

第43页：以反转录合成的第一条

• 以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性,这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用,目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板,在反转录酶的作用下,合成出互补的DNA(cDNA),由此可构建出cDNA文库(cDNA library),从中筛选特异的目的基因,这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法

第44页：三、DNA的损伤与修复

• DNA的损伤与修复(一)损伤复制中DNA的突变造成基因结构功能的破坏

第45页：突变的意义–突变是进化、分化的分子基础–

• 突变的意义–突变是进化、分化的分子基础–只有基因型改变的突变–致死性的突变–突变是某些疾病的发病基础

第46页：修复•修复的类型及其机理

• (二)修复
• 修复的类型及其机理
• 错配修复
• 直接修复
• 切除修复
• 重组修复
• 应急反应(SOS反应,易错修复)

第47页：错配修复

• 错配修复(mismatch Repair)复制过程中:“旧链GATC序列中腺嘌呤N6甲基化”,“链未甲基化”MutS与MutL结合成MutSL双向移动直至遇到GATC序列MutH是核酸内切酶,切开链GATC位点。核酸外切酶切除新核苷酸链,直到将错配碱基切除

第48页：直接修复

• 紫外光照射可使相邻的两个T 形成二聚体
• 光修复:光修复酶的激活需300-600μm波长的光。分解二聚体
• 暗修复:核酸内切酶将其切除(高等动物)
• 人体内有甲基转移酶可直接修复异常的甲基化。TTAA

第49页：切除修复

• 碱基切除修复:AP位点
• 核苷酸切除修复
• 参与的酶有:DNA糖苷酶、AP内切酶、核酸内切酶,polⅠ, DNA连接酶

第50页：重组蛋白

• 重组蛋白RecA,polⅠ,连接酶参与损伤会保留下去
• 重组修复

第51页：应急反应

• 应急反应:······引起一系列复杂的诱导效应。功能是:DNA修复和导致变异。为求生存而出现。DNA损伤修复效应:诱导修复中某些关键酶和蛋白质的产生。诱变效应:诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶IV和VIDNA损伤面太大,复制难以继续。复制,修复的酶,重组蛋白RecA,调控蛋白LexA等组成一个庞大的调控网络。特异性很低.
• 诱导修复和应急反应(SOS)

第52页：DNA的突变

• (三)DNA的突变
• 突变类型碱基对的转换(点突变):转换和颠换错配(错义突变、无义突变)移码突变:缺失、插入和框移突变。片段插入或缺失、较大片段重组或重排
• 自发突变与人工诱变
• 诱变剂的作用433页

第53页：第三节RNA的生物合成和

• 转录——以DNA为模板,按碱基配对原则把DNA的序列信息抄录给RNA,在RNA聚合酶(依赖DNA的RNA聚合酶)的参与下合成RNA链
• 复制——以RNA为模板,按碱基配对原则,在RNA复制酶的参与下合成RNA链

第54页：在DNA指导下的RNA合

• 在DNA指导下的RNA合成(转录)启动子和终止子:DNA分子上的特定序列。转录单位:转录产物:mRNA 、rRNA、tRNA等
• 底物:NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)
• RNA链生长方向:5’→3’
• 不需引物
• 需DNA模板
• 需DNA指导的RNA聚合酶(无3‘-5’外切酶活性)

第55页：复制转录模板两股链均复制模板链复制原料

• 复制转录模板两股链均复制模板链复制原料dNTPNTP酶DNA-polRNA-pol特点半保留复制不对称转录产物子代双链DNAmRNA,tRNA,rRNA配对A-T,C-GA-U,C-T,T-A引物需要不需要合成链方向5’ 3’5’ 3’复制和转录的异同点

第56页：编码链与模板链不同的基因使用不同的模板链

• 编码链与模板链不同的基因使用不同的模板链

第57页：RNA聚合酶

• 原核生物prokaryotes的RNA聚合酶(E.coli,480kD)
• 真核生物Eukaryotes的RNA聚合酶Ⅰ(A)Ⅱ(B)Ⅲ(C)定位核仁核质核质转录产物5.8S、18S、28SrRNAhnRNA mRNAtRNA、5SrRNA对鹅膏蕈碱耐受极敏感中度敏感

第58页：转录的过程

• 转录的过程

第59页：DNA指导

• (一)DNA指导的RNA聚合酶456页表λ5个亚基组成,除σ亚基外称核心酶。抑制剂利福平
• 此酶不需引物,无校对功能,局部解开DNA的两条链
• 活性部位位于β-亚基上
• 大肠杆菌RNA聚合酶

第60页：转录反应可以分为4个阶段

• 模板识别:RNA聚合酶的σ(因子)亚基的引导。不同的σ因子识别不同类型的启动子。启动子序列的测定:Pribnow等人用足迹法在-10的位置有:TATAATG(Pribnow boxTATAT)在-35的位置有:TTGACA的序列(Sextama-box)。RNA聚合酶在DNA上滑动到-35的位置认出起始序列开始松弛结合,当行走到-10位置便和DNA紧密结合。DNA双链被局部解开,在起始位点起始转录

第61页：

第62页：35区的序列与起始点的辨认有关

• -35区的序列与起始点的辨认有关,称为辨认位点,
• -10区的序列称为Pribnow盒(box) 结合位点

第63页：σ(2)转录的起始

• σ
• 转录的起始:按碱基配对原则合成5~7个核苷酸的链

第64页：转录的延伸

• 转录终止:需
• 因子的终止。不需
• 因子的终止

第65页：真核生物有3种转录酶

• 真核生物有3种转录酶:每一种都有自己的启动子类型
• 真核生物RNA聚合酶RNA聚合酶II的启动子结构为多部位结构:例:TATA-box:在-25区,与RNA聚合酶的定位有关462页转录过程分4个阶段
• 装配:由多种转录因子识别启动子,和RNA聚合酶在起点上形成前起始复合物。促进转录。与原核生物不同
• 起始
• 延长
• 终止其间各种因子的作用比细菌复杂

第66页：RNA的转录后的加工

• (二)RNA的转录后的加工
• 原核生物中RNA的加工主要是rRNA和tRNA的加工
• rRNA前体的加工:甲基化修饰;RNaseⅢ切割
• tRNA前体的加工:基因成簇或混合存在
• 核酸内切酶(大肠杆菌RNAase P,由RNA和蛋白质组成,其中RNA可独立完成催化)在tRNA的两端切开
• 核酸外切酶从3’端逐个切除附加序列,进行修剪
• 在tRNA的3’端加上-CCAOH(有些本身就有)
• 核苷的修饰
• mRNA前体的加工:大多不需加工,一经转录即可翻译,但也有少数需将多顺反子加工成较小单位

第67页：真核生物中

• rRNA前体的加工(rRNA基因几十至几千,成簇存在)自催化剪切:对有内含子的rRNA前体;甲基化与切割:由核仁小RNA(snoRNA)指导。核仁:是rRNA合成、加工和装配成核糖体场所
• tRNA前体的加工:tRNA的基因数目要比原核生物大得多
• mRNA前体(hnRNA,核内不均一RNA)的加工hnRNA转变为mRNA的加工过程包括
• 5’端形成特殊的帽子结构m7G5’ppp5’Np-
• 在3’端切断并加上一个poly(A)的尾巴;
• 通过剪接除去转录来的内含子;编辑
• 链内部核酸的甲基化。SnRNA(小分子细胞核RNA)参与Pre-RNA前体的剪接。SnoRNA(小分子细胞核仁RNA)参与Pre-RNA前体的甲基化

第68页：核酶（ribozyme）

• 核酶(ribozyme)----具有催化活性的RNA1982 T.R. Cech 四膜虫rRNA前体1983 S.Altman RNase P 对tRNA前体加工

第69页：RNA的拼接、编辑和再编码拼接

• (三)RNA的拼接、编辑和再编码拼接:切除内含子。(GT-AG规则)编辑:编码序列的改变。再编码:RNA编码和读码方式的改变。生物学意义?

第70页：

第71页：

第72页：

第73页：真核生物基因的外显子转录提问

• 真核生物基因的外显子转录提问:如何实现跨越内含子转录外显子区呢?绕环闭合内含子区域

第74页：锤头状核酶结构

• Ribozymehammar head

第75页：RNA生物功能的多样性488-490页

• (四)RNA生物功能的多样性488-490页

第76页：二、RNA的复制

• RNA的复制(RNA病毒)
• 个别噬菌体RNA病毒进入宿主细胞后,RNA以自身为模板,两次复制,形成病毒RNA病毒RNARNA互补链新病毒RNA复制复制翻译病毒蛋白RNA复制酶组装成新病毒

第77页：小结•复制子、复制体、冈崎片段

• 小结
• 复制子、复制体、冈崎片段、DNA的半不连续复制、增强子、σ因子和
• 因子(Rho)、逆转录、SOS反应
• 原核生物DNA复制有关的酶及蛋白质因子
• DNA指导下DNA聚合酶和DNA指导下RNA聚合酶的反应特点(转录与DNA复制的异同)
• 掌握DNA突变的类型、概念和损伤的修复方式
• 掌握半保留复制,半不连续复制的概念
• DNA复制的忠实性(与哪些因素)
• DNA的突变类型?
• 逆转录酶的几个特点?思考题:第436页2,4,5,6,10,11,13,14 503页2,18