05 第二节.ppt

第1页：第一章蛋白质第一节氨基酸第二节

• 第一章蛋白质第一节氨基酸第二节蛋白质的共价结构第三节蛋白质的三维结构第四节蛋白质结构与功能的关系第五节蛋白质的分离、纯化和表征

第2页：第二节蛋白质的共价结构

• 蛋白质通论
• 肽
• 蛋白质一级结构
• 蛋白质的一级结构与生物功能
• 肽与蛋白质的人工合成本节小结

第3页：一、蛋白质通论

• 蛋白质通论(一)蛋白质的化学组成与分类
• 元素特点:蛋白质的含氮量接近于16%
• 蛋白质系数:1克氮所代表的蛋白质质量(克数)。即6.25
• 凯氏定氮法测定蛋白质含量:(参看实验讲义)粗蛋白含量=样品含氮量×6.25蛋白质含量=样品蛋白氮×6.25
• 单纯(简单)蛋白质与缀合(结合)蛋白质及分类158页缀合(结合)蛋白质:共价键结合;非共价键结合
• 蛋白质按生物学功能分类

第4页：

第5页：蛋白质构象和蛋白质结构

• (三)蛋白质构象和蛋白质结构
• 构象(conformation)

第6页：蛋白质结构的不同组织层次

• 结构组织层次
• 四级结构
• 介于二和三级结构之间:超二级结构和结构域

第7页：蛋白质功能的多样性

• (四)蛋白质功能的多样性
• 蛋白质是构成生物体的基本成分
• 蛋白质具有多样性的生物学功能催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、其它。功能大分子

第8页：肽(是氨基酸的线性聚合物

• 肽(是氨基酸的线性聚合物)(一)肽键、二硫键、活性肽、1. 肽键
• 具有部分双键特性,不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化
• 肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化
• 除脯氨酸外多以反式结构存在

第9页：肽链的N端与C端

• N 端C 端
• N-端与C-端
• 二肽、…… …… 12肽
• 寡肽:25(10个)个氨基酸残基以下
• 多肽:多于25个(10个)氨基酸残基的肽链
• 氨基酸的顺序:是从N-端至C-端氨基酸残基
• 肽的命名
• 环状肽:肽

第10页：肽平面、肽单位、二面角

肽平面

连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上

肽单位

肽链主链上的重复结构,Cα-CO –NH –Cα

二面角

在多肽链里,Cα碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。Cα碳原子上的Cα-C 和Cα–N 可以绕轴旋转,角度为ψ和φ,这就是α-碳原子上的一对二面角。它决定了由α-碳原子连接的两个肽单位的相对位置

第11页：肽的物理和化学性质

• 肽的晶体是离子晶格,溶点高
• 具有两性解离和等电点:肽的酸碱性质--决定于末端α-氨基和α-羧基及R基。pH > R基pKa [HA] < [A-]pH < R基pKa [HA] > [A-]多肽链中可解离功能团的pKa值(记)例:Gly –Glu –Lys –Ala
• 具有旋光性
• 茚三酮反应、α-氨基和α-羧基及R基的反应.注:茚三酮反应不是肽的特有反应。N端是脯氨酸或焦谷氨酸时无α-氨基试剂的反应具有双缩脲反应:(参看实验讲义)
• 具紫外吸收:在280nm处有最大吸收峰,可进行肽类定量测定(原因是:含色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)

第12页：二硫键:22半胱氨酸与胱氨酸

• 二硫键:22半胱氨酸与胱氨酸

第13页：胰岛素的A链与B链结构

• 胰岛素611772019

第14页：天然存的活性肽

• 具有特殊的生理功能,常称为活性肽
• 含有非蛋白质氨基酸和肽键。例
• α-鹅膏蕈碱环状八肽,剧毒毒素。能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性

第15页：谷胱甘肽

• 谷胱甘肽:γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSGGSH;在红细胞中作为巯基缓冲剂存在,维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态

第16页：三、蛋白质的一级结构

• 蛋白质的一级结构(共价结构、化学结构)指多肽链中氨基酸的序列。包括二硫键的位置。N 端C 端

第17页：蛋白质一级结构的测定要求

• (一)蛋白质一级结构的测定要求
• 样品必须是均一的。纯度在>97% 以上
• 知道蛋白质的相对分子质量
• 测定蛋白质分子中多肽链的数目
• 经测定末端基(C端或N端),看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例?

第18页：拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键

• 借助非共价相互作用缔合的(亚基之间)采用变性剂:8mol/L尿素;6mol/L盐酸胍;SDS处理。2.通过共价二硫桥(S-S)交联的采用氧化剂或还原剂:将二硫键断裂。3.分离、纯化多肽链猪

第19页：二硫键的断裂使用的还原剂有

• 二硫键的断裂使用的还原剂有:巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)β-巯基乙醇H0-CH2CH2-SH巯基保护剂:碘乙酰胺、碘乙酸、3-溴丙胺等

第20页：分析每一多肽链的氨基酸组成待测样品经酸

• 分析每一多肽链的氨基酸组成待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解,用氨基酸分析仪进行测定(或层析法)。表示方法:每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数。或100克蛋白质中含氨基酸的克数

第21页：测定多肽链的氨基酸序列

• N-末端氨基酸测定
• Sanger试剂(DNFB或FDNB)
• DNS(丹磺酰氯法)
• PITC(苯异硫氰酸酯、Edman法)单肽链+PITC→PTC-多肽→酸性有机溶剂中加热→PTH-氨基酸+余下的肽链抽提:用有机溶剂,层析鉴定。可连续降解几十个氨基酸残基
• 氨肽酶法
• C-末端分析
• 肼解法:单肽链+无水肼→加热→氨基酸肼+C-末端氨基酸→加FDNB
• 羧肽酶法(C-末端第二个是Pro时不作用)羧肽酶A:能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸羧肽酶B:只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键
• 还原法:单肽链+硼氢化锂→C-末端氨基酸被还原成相应的α-氨基醇→水解,层析

第22页：多肽链的部分裂解与肽段分离纯化

• 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化要求:选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得混合物进行分离纯化。经N未端和C未端测定,确定出每一肽段的序列

第23页：酶解法(表现出专一性)胰

酶解法(表现出专一性)胰蛋白酶

水解Lys、Arg的羧基所形成的肽键。糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶):R1=Phe、Trp、Tyr嗜热菌蛋白酶:胃蛋白酶:氨肽酶和羧肽酶

化学法溴化氰水解法(CNBr)

切割Met的羧基所形成的肽键。用羟胺断裂:它断裂-Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质中出现机率低,适于分子量大的蛋白质序列的测定

第24页：确定肽段在多肽链中的次序所得资料

• 确定肽段在多肽链中的次序所得资料:N-末端残基HC-末端残基S第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO借助重叠肽确定肽段次序:180页:胰岛素B链的测序HOWT OUS EOVERLAPS

第25页：二硫键位置的确定

• 确定原多肽链中二硫键的位置肽内或肽间是否有二硫键?采用胃蛋白酶:专一性低,切点多。肽段比较小,分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围
• 有利于防止二硫键发生交换反应。肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳:暴露在过甲酸蒸气中使二硫键断裂++

第26页：例:有一个A肽

• 例:有一个A肽:1)酸水解得到:Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met;2)当A肽与FDNB试剂反应后得:DNP-Ala;3)当A肽用CNBr降解时得到:游离的Ser和一种肽;4)当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽:一种含Ala、Arg,另一种含其它氨基酸5)当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽:一种含Met、Ser,另一种含其它氨基酸;问A肽的氨基酸排列顺序如何?答:Ala-Arg-Glu-phe-Met-Ser

第27页：四、蛋白质的一级结构与生物功能

• 蛋白质的一级结构与生物功能
• 同源蛋白质的物种差异与生物进化
• 同源蛋白质可变残基不变残基序列同源
• 例:细胞色素C、肌红蛋白与血红蛋白。酶结合位

第28页：不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数

• 不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数目的比较

第29页：系统树

• 系统树

第30页：

第31页：镰刀状贫血的分子基础

• 分子基础:在血红蛋白分子的四条肽的574个氨基酸残基中,只有两条β链中的两个谷氨酸残基分别被两个缬氨酸残基所代替,即能引起严重的病态。HbAH2N Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys COOHHbS H2N Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys COOHβ链1 2 3 4 5 6 7 8

第32页：一级结构的局部断裂与蛋白质的激活

• 血液凝固的生物化学机理凝血系统:至少含有12种凝血因子,以无活性的前体或酶原形式存在。纤溶系统:纤溶酶原-----单链糖蛋白纤溶酶原激活剂(PA) ---主要是t-PA其他

第33页：凝血系统内在途径外

• 凝血系统内在途径外在途径异物表面接触组织损伤高相对分子质量激肽原XⅡⅦaXⅠⅠXⅠX aⅧaXXⅡaXⅠaX aXⅦVa Ca2+ⅡⅡaⅠIaXⅢa激肽释放酶交联的血纤蛋白凝块凝血酶原凝血酶血纤蛋白原血纤蛋白

第34页：凝血酶原的结构示意图N端C端

• 凝血酶原的结构示意图N端C端ABSS274323释放的肽段凝血酶SS凝血酶凝血酶原激酶

第35页：血纤蛋白原的结构示意图

• 分子含29个二硫键,6条多肽链由这些二硫键交联成一个整体分子
• 凝血酶断裂血纤蛋白原中央球状区的4个Arg-Gly键,释放出的肽称血纤肽

第36页：血纤蛋白原转变为软血纤蛋白块

• 血纤蛋白原转变为软血纤蛋白块血纤蛋白原H2O血纤肽凝血酶血纤蛋白单体聚集血纤蛋白单体以非共价键结合成血纤蛋白软凝块

第37页：纤溶系统t-PA激活纤溶酶原及纤溶酶降解

• 纤溶系统t-PA激活纤溶酶原及纤溶酶降解血纤蛋白凝块t -PA纤溶酶原纤溶酶血纤蛋白凝块表面血纤蛋白血纤蛋白降解物(肽碎片)

第38页：胰岛素(胰岛β-细胞产生

• 胰岛素(胰岛β-细胞产生)主要功能:是降低体内血糖含量。1953年F.Sanger等测定出了牛胰岛素的氨基酸顺序。每种蛋白质都具有特异而严格的氨基酸种类、数量和排列顺序的一级结构。1965年9月,中国科学院生物化学研究所、有机化学研究所和北京大学化学系协作,在世界上第一次人工合成了结晶牛胰岛素。猪

第39页：由A、B两条链通过二硫键相连

• 由A、B两条链通过二硫键相连SSSSSSANH2BNH2611772019COOHCOOH

第40页：胰岛素的体内合成前

• 胰岛素的体内合成前胰岛素原:信号肽

第41页：信号肽酶前胰岛素原

• 信号肽酶前胰岛素原胰岛素原肽酶肽酶胰岛素C肽

第42页：本节小结

• 理解并掌握肽键、肽平面、二面角的概念,肽键的双键性质以及由此带来的对蛋白质肽键构象的影响
• 蛋白质的酸碱性质及等电点
• 理解并掌握蛋白质一级结构及与生物功能的关系,能根据实验事实推断简单多肽的一级结构
• 习题:195页2, 3,4, 6,7, 8, 9