04 第一节.ppt

第1页：第三章蛋白质

• 第三章蛋白质(123页第3,4,5,6,7章)第一节氨基酸第二节蛋白质的共价结构第三节蛋白质的三维结构第四节蛋白质结构与功能的关系第五节蛋白质的分离、纯化和表征本节小结Protein

第2页：第一节氨基酸

• 氨基酸----蛋白质的构件分子
• 氨基酸的分类
• 氨基酸的酸碱化学
• 氨基酸的化学反应
• 氨基酸的光学活性和光谱性质
• 氨基酸混合物的分析分离

第3页：一、氨基酸

• 氨基酸----蛋白质的构件分子(一)蛋白质的水解(可被酸、碱、蛋白酶水解)L -和L或D -α-氨基酸的混合物完全水解酸或碱催化水解几种蛋白酶催化水解部分水解得到多肽片段L-α-氨基酸的混合物蛋白质

第4页：组成蛋白质的20种氨基酸的结构

• (二)组成蛋白质的20种氨基酸的结构
• 结构通式
• 结构特点
• 除脯氨酸外,都属于L-α氨基酸
• 除R是H(甘氨酸)都具有旋光性(+,-),同种氨基酸构型相反旋光性也相反。每种氨基酸都有特殊的结晶形状,可用来鉴别氨基酸。氨基酸在中性pH时,α氨基和羧基以离子形式存。COOHCαHH2NRCOO-CαHRH3N+或

第5页：

第6页：氨基酸的旋光异构体

• 氨基酸的旋光异构体

第7页：二、氨基酸的分类

• 氨基酸的分类(一)常见的蛋白质氨基酸20种(或称基本氨基酸)
• 根据侧链R基团的化学结构
• 脂肪族氨基酸:最多
• 芳香族氨基酸
• 杂环氨基酸
• 根据侧链R基团是否有极性(在pH7左右时表3-2)
• 非极性R基氨基酸
• 不带电荷的极性R基氨基酸
• 带正电荷的R基氨基酸(组氨酸R基pH7附近解离)
• 带负电荷的R基氨基酸

第8页：根据分子中羧酸和氨基的比例

• 中性氨基酸
• 酸性氨基酸:Asp、Glu
• 碱性氨基酸:Lys、His、Arg
• 根据人体能否自身合成
• 必需氨基酸:Val,Leu,Ile,Thr,Met,Lys,Phe,Trp
• 非必需氨基酸:其余(二)不常见的蛋白质氨基酸是在蛋白质合成后由常见的氨基酸经修饰而来的(羟脯氨酸和羟赖氨酸等)。(三)非蛋白质氨基酸(150多种第129页)有一些是重要的代谢物前体或代谢中间物(丙氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸等)

第9页：

第10页：三、氨基酸的酸碱化学

• 氨基酸的酸碱化学(一)氨基酸的兼性离子形式在晶体和水中以偶极离子形式存在(二)氨基酸的解离依照Bronsted-Lowry的酸碱质子理论HA A-+ H+氨基酸是一类两性电解质

第11页：氨基酸的兼性离子与解离

• COO-CαHRH3N+碱的作用酸的作用

第12页：甘氨酸的滴定

• 分步解离:K1= [A0][H+][A+][A-][H+]K2 = [A0]K1= [H+] pK1= pHK2= [H+] pK2= pH

第13页：氨基酸解离的pH计算公式

• Handerson-Hasselbalch公式pH = pKa + lg([A-]/ [HA] )= pKa + lg([碱]/[酸] )
• 可计算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例
• 氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关
• 表:氨基酸的酸碱化学133页
• pK:基团一半解离时的pH。pH = pKa + lg[质子供体][质子受体]

第14页：谷氨酸的滴定(解离)曲线谷氨酸

• 谷氨酸的滴定(解离)曲线谷氨酸

第15页：组氨酸的滴定(解离)曲线组氨酸

• 组氨酸的滴定(解离)曲线组氨酸

第16页：赖氨酸的滴定(解离)曲线赖氨酸

• 赖氨酸的滴定(解离)曲线赖氨酸

第17页：氨基酸的等电点在某一特定pH值溶液时

• (三)氨基酸的等电点在某一特定pH值溶液时,氨基酸主要以两性离子形式存在,净电荷为零,在电场中不向电场的正极或负极移动,这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。+H+HHHA0A-A+K1K2

第18页：等电点的计算

• 侧链不含离解基团的中性氨基酸pI= (pK1+ pK2 )/
• 侧链含有可解离基团的氨基酸
• 酸性氨基酸:pI = (pK1+ pKR)/2
• 硷性氨基酸:pI = (pK2+ pKR)/2
• 半胱氨酸:pI = (pK1+ pKR)/2
• 酪氨酸:pI = (pK1+ pK2)/2

第19页：氨基酸的甲醛滴定不能直接用酸、碱滴定来进

• (四)氨基酸的甲醛滴定不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定?

第20页：

第21页：四、氨基酸的化学反应

• 氨基酸的化学反应
• α-氨基参加的反应
• α-羧基参加的反应
• α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• 侧链R基参加的反应

第22页：α-氨基参加的反应

• (一)α-氨基参加的反应
• 与亚硝酸反应标准条件下测定生成的氮气体积,即可计算出氨基酸的量。生成的氮气一半来自氨基酸。室温下

第23页：与酰化试剂反应

• 用于多肽链N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定
• 在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂。51

第24页：烃基化反应

• Sanger试剂( DNFB或FDNB )首先被英国的Sanger用来鉴定多肽蛋白质的N末端氨基酸。Sanger(桑格)其人:英国化学家,在生物化学领域的贡献很大,他两次获诺贝尔奖1958和1980年;1953年确定了牛胰岛素一级结构;1975年和1977年确定了DNA的两种用酶测序的方法加减法和终止法。DNP-氨基酸黄色2,4-二硝基氟苯弱碱性溶液

第25页：Edman降解法（PITC法）

• Edman 反应(PITC)
• 用于鉴定多太或蛋白质的N端氨基酸及序列测定。4. 形成西佛碱反应
• 脱氨基反应苯氨基硫甲酰衍生物PTC-氨基酸苯乙内酰硫脲衍生物PTH-氨基酸(无色)在弱碱中硝基甲烷

第26页：α-羧基参加的反应

• (二) α-羧基参加的反应(第138页)
• 成盐和成酯:羧基被保护,氨基被活化,重金属盐不溶于水。2.成酰氯反应:氨基被保护,羧基被活化,在多肽人工合成中常用。3.脱羧基反应
• 叠氮反应:常用于多肽的合成

第27页：α-氨基和α-羧基共同参加的反应

• (三) α-氨基和α-羧基共同参加的反应
• 与茚三酮反应:弱酸性溶液中与氨基酸共热生成紫色物质。检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成的是黄色化合物(λ440)。λ570

第28页：成肽反应

• 成肽反应

第29页：侧链R基参加的反应功能团有

• (三)侧链R基参加的反应功能团有:羟基、酚基、巯基(包括二硫键)、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基、非α-氨基和非α-羧基等。侧链功能团发生共价化学改变--蛋白质的化学修饰

第30页：酪氨酸的酚基米伦反应

• 酪氨酸的酚基米伦反应(Millon):酚基与HgNO
• 与Hg(NO3)2和HNO3作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。Pauly反应:酚基与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。Trp苯环------红色
• 精氨酸的胍基坂口反应(Sagakuchi):胍基与α-萘酚,次溴酸盐作用生成红色物质。3.Cys侧链上的巯基(-SH)在微碱性pH下-SH基解离成“-CH2-S –”

第31页：与卤化烷生成稳定的烷基衍生物

• 与卤化烷生成稳定的烷基衍生物

第32页：巯基能打开氮丙啶的环

• 保护-SH 以防被氧化
• 侧链似赖氨酸,为胰蛋白酶水解肽链提供了新位点

第33页：巯基能和各种金属离子形成络合物

• 是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物方法之一
• -SH 酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时,将导致酶失活
• 巯基易受空气或其他氧化剂氧化硫醇的两种氧化衍生物:二硫化物和磺酸基对氯汞苯甲酸

第34页：过甲酸氧化与磺酸基

• 过甲酸HCOOOH磺酸基

第35页：二硫键在稳定蛋白质的构象上起作用

• 二硫键在稳定蛋白质的构象上起作用。二硫键

第36页：二硫键的打开

氧化剂

HCOOOH

还原剂

巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等极易被氧化,需与卤化烷试剂作用将其保护。过甲酸巯基化合物HO-CH2-CH2-SH

第37页：五、氨基酸的光学活性和光谱性质第143页

• 氨基酸的光学活性和光谱性质第143页(一) 氨基酸的旋光性(课下看第3页)
• 不对称碳原子
• 旋光性物质:右旋性(+)、左旋性(-)
• 光学异构体:有一个不对称碳原子就有2个光学异构体,有两个不对称碳原子就有4个光学异构体

第38页：比旋光度

• 比旋光度(旋光率):旋光度(DtD)的表示方法。即单位浓度和单位长度下的旋光度。是旋光物质的特征物理常数。式中:L 是管的长度(分米),C 代表浓度( 即在100ml溶液中所含溶质的克数). D 钠光灯(D线,λ:589.6 与689.0 nm)为光源。“+”和“-”:分别表示右旋和左旋。旋光符号和大小:取决于R基性质和溶液pH有关

第39页：消旋作用(外消旋物与内消旋物)

• 消旋作用(外消旋物与内消旋物)

第40页：

第41页：.氨基酸的光谱性质

• (二).氨基酸的光谱性质
• 紫外吸收光谱(200-400)
• 酪氨酸
• max=275nm,
• 苯丙氨酸
• max=257nm,
• 色氨酸
• max=280nm,A(OD)=εCL

第42页：蛋白质紫外吸收与含量测定

• 蛋白质在280nm处有最大吸收峰用紫外分光光度计可以测定样品中蛋白质的含量.根据Lambert-Beer 定律:IOI0I0A或OD=lg =εC LI
• 核磁共振波谱(NMR)εLODC =

第43页：六、氨基酸混合物的分析分离分配层析原理

• 氨基酸混合物的分析分离分配层析原理(俄国植物学家1903年)混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。固定相流动相层析系统固相液相半液相液相气相支持物静相动相被分离的物质

第44页：分配定律及分配系数溶质在溶剂I中的浓度

• 分配定律及分配系数溶质在溶剂I中的浓度(CA动相)溶质在溶剂II中的浓度(CB静相)分配系数(Kd) =某一物质在A相中的总量某一物质在B相中的总量有效分配系数(Keff) =

第45页：逆流分溶计算公式150页

• (一)逆流分溶计算公式150页

第46页：一定量的某一溶质在

• 一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时,转移次数越多,即分溶管数越多,其分溶曲线越集中,即峰形越窄而高,这样有利于混合物中各物质的完全分离

第47页：纸层析•支持物:纸,纸上的羟基具有亲水性

• (二) 纸层析
• 支持物:纸,纸上的羟基具有亲水性,因此能吸附一层水作为固定相,而通常有机溶剂作为流动相
• 原理:是根据溶质物质的极性进行分离的。溶剂前层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖

第48页：相对迁移率Rf = X/Y图3-8

• 相对迁移率Rf = X/Y图3-8

第49页：

第50页：柱层析填充物

• (三) 柱层析填充物:亲水性的不溶物质,如纤维素、淀粉、硅胶等。洗脱剂:与水不互溶的溶剂,如苯酚、正丁醇等

第51页：层析柱

• 层析柱

第52页：离子交换层析

• (四)离子交换层析
• 离子交换树脂基质:是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯(单体)-苯二乙烯(交联剂)进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子化合物
• 树脂一般都制成:球形的颗粒
• 带电基团:是通过化学反应引入基质
• 有阳离子和阴离子两种交换树脂。B-A+C+D-

第53页：阳离子交换树脂与阴离子交换树脂

• 阳离子交换树脂与阴离子交换树脂氨基酸与树脂的亲和力:取决于它们之间的静电吸引和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用

第54页：离子交换层析

• 离子交换层析

第55页：吸附层析吸附剂

• (五) 吸附层析吸附剂:如氧化铝、硅胶、活性炭等固体物质都具有吸附性能。各种成分的分离过程: 溶解、吸附、再溶解、再吸附(六) 薄层层析硅胶粉吸附薄层层析纤维素粉分配层析类型支持剂盖子层析缸溶剂薄层板

第56页：气液层析流动相为气体

• 气液层析流动相为气体(氢、氦、氮),固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时称为气液层析或气液色谱,简称为气相色谱。高效(压)液相层析HPLC固定相支持剂颗粒很细,因而表面积很大。溶剂系统采取高压

第57页：本节小结

• 本节小结1.20种氨基酸的结构特征;甘氨酸和脯氨酸结构特点
• 酸性氨基酸与碱性氨基酸;必需氨基酸与非必需基酸;极性氨基酸与非极性氨基酸
• 两性离子;pK值与pI;电泳
• α-氨基、α-羧基和侧链巯基的化学反应;茚三酮反应
• 旋光性;苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的紫外吸收特点
• 纸层析和离子交换层析的原理及方法(会作题)书后习题:155页1,2,3,5,6,10,11,13,14,15