11 第十章 核酸的生物合成.ppt

第1页：第十章 核酸的生物合成

第十章核酸的生物合成

第2页：术语简介基因和蛋白质的命名缩写

术语简介基因和蛋白质的命名缩写:

• 1)基因通常用3个能反映其基本功能的斜体小写字母表示。如:dna 基因影响DNA的复制,rec 基因影响DNA的重组。当几个基因影响同一过程时,通常按发现的先后顺序加上A、B、C等。
• 2)对基因的蛋白质产物命名,不用斜体,且第1个字母大写。如:dnaA和recA基因的产物叫做DnaA和RecA 。模板(template): 一种使分子能按一定顺序排列并连接形成有特定序列和功能的生物大分子的结构。

第3页：第一节 DNA的生物合成一. DNA的半

第一节DNA的生物合成一. DNA的半保留复制Watson和Crick开创性的论文,对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾:“不出我们的意料,我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。

”复制时, 每一条DNA链在新链合成中充当模板,按碱基配对方式形成两个新的DNA分子,每个分子都含有一条新链和一条旧链,这种复制方式即半保留复制(semiconservative replication)。

第4页：新链旧链DNA的半保留复制的生物学意

谢上的稳定性并非指DNA

一种惰性物质

第5页：半保留复制亲代第一代第二代半保留复制

半保留复制亲代第一代第二代半保留复制的实验证据1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。

第6页：重轻杂和DNA杂和DNA

重轻杂和DNA杂和DNA

（本页以图示为主，源文件提取到的文字较少，建议对照原图说明）

第7页：二. 复制的起点和方向复制是一个高度

• 二. 复制的起点和方向复制是一个高度协调的过程,母链解链和复制同时进行。(一)概念
• 复制子(replicon):基因组能独立进行复制的单位。
• 起点(origin):控制复制起始,是含有100~200个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质(大肠杆菌中称为Dna A蛋白)。

第8页：终点

终点(terminus):终止复制的序列位点. 复制叉(replication fork):复制开始后由于DNA双链解开,在两股单链上进行复制,形成在显微镜下可看到的叉状结构。

第9页：

第10页：原核生物

原核生物:只有一个复制子真核生物:多个复制子,多个起点,形成多个“复制眼”或“复制泡”

第11页：

第12页：(二)起始点和方向

起始点和方向

• 1.原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的,如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TTATCCACA,多次出现,可被酶识别。
• 2.方向:大多是双向、对称复制, 也有单向或不对称的。
• 3.速度:原核生物复制叉移动快(约105bp/min);真核生物复制叉移动慢(约5×102~5×103bp/min)

第13页：双向复制复制叉起点起点单向复制

双向复制复制叉起点起点单向复制

第14页：复制起始点、复制子与复制叉

复制起始点、复制子与复制叉(动画演示)

第15页：三. 原核细胞DNA的复制DNA聚合

A-pol)DNA聚合酶

一种催化依赖模板的由脱氧核苷三磷酸前体合成DNA的酶

第16页：DNA聚合酶的反应特点

DNA聚合酶的反应特点:♦4种dNTP底物:(dATP dGTP dCTP dTTP);

♦接受模板指导:解开成单链的DNA母链;

♦需引物提供3′-OH;♦新链生长方向:5′→3′;♦产物DNA性质与模板相同。

第17页：此外, DNA复制过程中还需其它酶和

此外, DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板DNA链引物新加入的dNTP脱氧核糖亲核攻击5′3′生长的DNA链*引物(primer) 是一和模板链互补的线性片段, 其上带有能与核苷酸相结合的游离3′-OH. 引物通常是寡聚RNA.

第18页：Arthur

Arthur Kornberg Won the 1959 Nobel Prize in Medicine for his discovery of the mechanism in the biological synthesis of deoxyribonucleic acid(before Watson and Crick won theirs!)

第19页：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

• 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ—polⅠ也称Kornberg酶, 是各种DNA聚合酶中研究的最透彻的,它的一些特点代表了DNA聚合酶的基本特点:(
• 1)pol Ⅰ的性质分子量:103 000,单链,球形,活性部位含Zn2+,电镜下可以看到二聚体,每个细胞有400个酶分子。

第20页：功能:①5′→3′聚合酶活性;酶与

′→5′外切酶活性;主要

对新生DNA链进行校对,防止“错配”③5′→3′外切酶活性

第21页：模板聚合酶活性位点引物3 ′ → 5

模板聚合酶活性位点引物3 ′ → 5 ′外切酶位点

第22页：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ——polⅡ(

• 1)多亚基, 聚合酶亚基(单链) 分子量为88 000,每个细胞有100个酶分子(
• 2)功能:①5′→3′聚合酶活性;②3′→5′外切酶活性。(该酶无5′→3′外切酶活性;且活性低)目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。

第23页：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ——polⅢ真正的DNA复制酶,1972年发现(

• 1)pol Ⅲ 是真正起复制作用的酶,由10种亚基组成不对称二聚体, α、ε、θ组成核心酶(
• 2)功能:①5′→3′聚合酶活性;②3′→5′外切酶活性。该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸,是复制延长中真正起催化作用的酶。(该酶无5′→3′外切酶活性)

第24页：E. coliDNA聚合酶Ⅲ不对称二

E. coliDNA聚合酶Ⅲ不对称二聚体ε''ε

第25页：可滑动的夹持器亚基催化亚基3´→5´

可滑动的夹持器亚基催化亚基3´→5´外切酶亚基前导链合成后随链合成夹持器装置催化亚基亚基保持核心酶的二聚体结构

第26页：α亚基具有5′→3′方向合成DNA的

α亚基具有5′→3′方向合成DNA的催化活性ε亚基具有3′→5′外切酶活性,起校对功能,可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性亚基可能起组建的作用β亚基犹如夹子,功能是识别引物、夹住DNA分子向前滑动亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物,主要功能是帮助亚基夹住DNA(也称夹子装置器),并有增强核心酶活性的作用

第27页：大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较

大肠杆菌 3 种 DNA 聚合酶性质比较：下表列出 polⅠ、polⅡ、polⅢ 的主要性质差异。

第28页：

第29页：冈崎片段和半不连续复制

冈崎片段和半不连续复制( 冈崎片段(Okazaki fragment):在不连续的后随链DNA合成中形成的DNA短片段,在原核生物有1000~2000核苷酸,真核生物约100~200核苷酸。

1968年冈崎发现。

(二)双链DNA复制的分子机制

第30页：(2)DNA的半不连续复制

strand),另一条链

不连续合成的(滞后链或后随链,laggingstrand),这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制

第31页：

第32页：

第33页：35353´5´3´5´解链方向领头

35353´5´3´5´解链方向领头链(leading strand)后随链(lagging strand)DNA的半不连续复制3´5´

第34页：复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领

复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’3’5’DNA的双向复制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’

第35页：DNA半不连续复制中的RNA引物

DNA半不连续复制中的RNA引物(

• 1)前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。(
• 2)引物合成酶(Dna G):是以DNA为模板的RNA聚合酶(合成方向5′→3′), 合成的引物长度为5~10nt。(
• 3)引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。(
• 4)DNA聚合酶Ⅰ切除前导链及冈崎片段的引物后, 填补空缺,由DNA连接酶将切口连接。

第36页：RNA引物的合成称作“引发”。

成熟的DNA

不含RNA的,RNA引物最终被DNA所置换

第37页：DNA连接酶催化两段DNA之间的连接

3、DNA连接酶(ligase)催化两段DNA之间的连接:35535353HOPDNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi′′′′′′′′+

第38页：DNA连接酶

NA中一条链有切口,一端

3′-OH,另一端是5′-磷酸基,连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键,而使切口连接

第39页：母本DNA双链的分离

母本DNA双链的分离(

• 1)DNA解链酶(解螺旋酶, DNA helicase, Dna B):通过水解ATP将复制叉前方的DNA双链打开。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。(
• 2)单链结合蛋白(single-strand binding protein, SSB):稳定已被解开的DNA单链,阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。(
• 3)DNA旋转酶(gyrase)或拓扑异构酶Ⅱ( type Ⅱtopoisomerase): 兼有内切酶和连接酶活性, 可迅速使DNA两条链断开又接上, 消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量, 同复制有关。

第40页：除连环数不同其他性质均相同的DNA分

除连环数(L)不同其他性质均相同的DNA分子称拓扑异构体

第41页：

第42页：

第43页：总结:原核生物DNA的复制过程

总结:原核生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为例)

• 双链的解开
• 起始——RNA引物的合成
• DNA链的延伸
• 终止

第44页：B. RNA引物的合成引发体先与

B. RNA引物的合成引发体先与DNA起始部位双链结合,通过引物合成酶形成前导链引物后,再沿5′→3′模板链与复制叉同向移动,在移动中断断续续形成冈崎片段的RNA引物。

A. 双链的解开DNA旋转酶(拓扑异构酶Π)、DNA解链酶、单链结合蛋白协同作用

第45页：C. DNA链的延伸在DNA

C. DNA链的延伸在DNA pol Ш的催化下,以四种dNTP为底物,在RNA引物的3 ′端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。

DNA链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 3'3'DNA-pol

第46页：①前导链的延长

①前导链的延长:DNA pol Ⅲ全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用,与复制叉同向。

第47页：②滞后链的延长

②滞后链的延长:DNApolⅢ全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。

由于模板形成环, 酶向前移动时, 滞后链合成片段也沿5′→3′方向生长, 与酶催化方向一致。

滞后链片段合成接近前方滞后链片段5′末端时, 模板被释放, 环消失。继续重复, 连续进行。

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第50页：

第51页：♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度

♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度, 其3′-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。

♦一旦冈崎片段合成完成,其RNA引物即被除去,通过DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之,并形成一个切口,此切口由DNA连接酶连接封闭。

第52页：D. 复制终止细菌环状染色体的两个复

D. 复制终止细菌环状染色体的两个复制叉向前推移,在终止区相遇而停止复制,复制体解体。

这样, 以两条亲代DNA链为模板,各自形成一条新的DNA互补链,结果形成了两个DNA双股螺旋分子。

就目前所知,起始阶段是DNA复制中唯一一个可以受调节的阶段,由于受到调节而使得DNA在一个细胞周期中只发生一次复制。

第53页：细菌复制终止区含有多个约22bp的终

细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点,E. coli 有7个终止子位点。

第54页：

第55页：复制的保真性 主要依赖3 种机制

• 复制的保真性( fidelity ) 主要依赖3 种机制:•聚合酶对碱基的选择;•3′→ 5′方向的外切核酸酶活性起校正作用;•复制后错配现象的特异性修复机制。
• 5.DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用大肠杆菌DNA复制错配率约10-9~10-10。其染色体中有4.5×106bp,平均每1 000~10 000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。

第56页：

第57页：小结-维持DNA复制准确性的因素

小结-维持DNA复制准确性的因素:内因:①按碱基配对原则(错配率10-4~10-

• 5)②DNA聚合酶的作用(错配率10-4~10-
• 5)• 对碱基的识别作用——选择正确的碱基参入到引物末端• 对底物的识别作用——先识别引物最后一个碱基是否正确, 后识别参入的dNTP是否正确• 校正阅读——3′→ 5′外切酶的作用③RNA引物最终被切除, 提高了复制准确性④复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统外因:• 四种dNTP要平衡;• Mn2+和Mg2+的比例、浓度(酶活)

第58页：真核生物的DNA聚合酶

• 真核生物的DNA聚合酶:至少5种——αβγδεDNA-pol α——现认为其功能只是合成引物DNA-polδ——在复制延长中起催化作用DNA-pol ε——校对、修复、填补(类似E.coliDNA pol I )DNA-pol γ——线粒体DNA合成DNA-pol β——核DNA修复
• 四、真核细胞DNA的复制——(DNA指导下的DNA合成)推测在复制叉上有一个DNA polα, 以合成引物; 两个DNA polδ, 分别合成前导链和滞后链。

第59页：

第60页：(二)真核生物中DNA的复制特点

真核生物中DNA的复制特点

• 1.真核生物染色体有多个复制起点,多复制眼,呈双向复制,多复制子。
• 2.冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。
• 4.真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制;而在快速生长的原核中,起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时,往往采用更多的复制起点。
• 5.真核生物有多种DNA聚合酶。
• 6.真核生物线性染色体两端有端粒结构,防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补,亦保持端粒的一定长度。

第61页：端粒端粒中心粒图真核生物染色体端粒

端粒(telomere)

真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其共同特点是一条链上富含T、G短序列的多次重复,而其互补链上富含A、C

第62页：端粒主要有两大生理功能

端粒主要有两大生理功能:(

• 1)维持染色体结构的完整性,防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和。(
• 2)防止染色体结构基因在复制时丢失,解决了末端复制的难题。DNA复制时,DNA聚合酶必须在RNA引物基础上从5′向3′方向延伸,而5′端RNA引物去除后因无引物的存在而不能复制,结果每复制一次染色体末端将丢失一段序列。端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的一部分,从而保护了染色体内部的结构基因。另外,有些研究还显示,端粒与核运动有关,可能对同源染色体的配对重组有重要意义。端粒的合成主要依靠端粒酶来催化。

第63页：线性DNA在复制完成后

53355335端粒酶

一种RNA-蛋白质复合体,它可以其RNA为模板,通过逆转录过程对末端DNA链进行延长

第64页：

第65页：端粒酶的爬行模型(动画演示)

端粒酶的爬行模型(动画演示)

第66页：

第67页：母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶

母链藉非标准碱基配对回折DNA聚合酶端粒合成完成进一步加工

第68页：

第69页：如上图所示, 端粒酶以其RNA为模板

• 如上图所示, (a)端粒酶以其RNA为模板, 通过逆转录作用, 催化富含G链的延伸; (b)端粒酶向端粒新3′端移动,继续以其RNA为模板, 催化富含G的DNA母链延长; (c)端粒酶反复移位, 通过逆转录反应使端粒富含G链增长到足够长度; (d)富含C链的空缺部分不需要引物酶合成引物提供3′-OH, 而是富含G的链突出的寡脱氧核苷酸d(GGGGTTTTGGGG)通过非Watson-Crick配对方式自身的GGGG之间按G
• G配对, 回折形成发卡并提供3′-OH; (e)由发卡引发富含C链在3′-OH以富含G链为模板, 由DNA聚合酶添加新的dNTP, 进一步延伸填补空缺, 间隙最后由DNA连接酶封口; (f)端粒DNA与端粒蛋白结合, 完成加工后, 形成完整的端粒。

第70页：

第71页：如上图所示, 端粒酶以其RNA为模板

如上图所示, (a)端粒酶以其RNA为模板, 使用右边的AAC与新掺入的TTG配对, 催化富含G链的延伸;

(b) 端粒酶向端粒新3′端移动, 此时模板RNA左边的AAC与3′端新掺入的TTG配对;

(c) 端粒酶在模板RNA指导下将6个一组GGGTGG添加到端粒G链3′端, 重复(a) ~(c)反应使端粒富含G链增长;(d) 富含G链充分延伸, 而空缺的富含C链部分由引物酶合成引物RNA, 其序列互补于富含G链3′端;(e) 在新合成引物引发下, DNA聚合酶合成DNA用以填补端粒富含C链的缺口;(f) 引物被切除后, 对应的富含G链突出10~16个核苷酸;(g) 这种带重复序列的端粒DNA与端粒蛋白结合后, 通过G·G配对自身回折在染色体末端形成套索结构(t环, telomere loop)。

第72页：归纳:生物细胞DNA复制分子机制的基

归纳:生物细胞DNA复制分子机制的基本特点P.254

第73页：五、反转录作用定义

苷酸顺序合成DNA的过程

反转录(reversetranscription,RT)

第74页：+RNA+DNA-RNA+DNA-D

+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反转录过程(以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化)单链病毒RNARNA-DNA杂交分子双链DNA(前病毒)反转录酶反转录酶逆转录酶是多功能酶,兼有3种酶的活性:RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性,专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA,可沿5'3'和3'5'两个方向起核酸外切酶的作用。

反转录酶也和DNA聚合酶一样, 沿5′3 ′方向合成DNA, 并要求短链RNA作引物。

第75页：cDNA

cDNA:利用反转录酶可合成出与任何RNA模板(mRNA,tRNA或rRNA)的碱基序列互补的DNA——互补DNA(complementary DNA, cDNA)。

几乎所有真核生物mRNA分子的3 ' 末端都有一段polyA, 当加入寡聚dT作为引物时,mRNA就可作为模板,在反转录酶催化下在体外合成与其互补的cDNA,为研究真核结构基因提供了有效途径。

反转录酶发现的理论和实践意义:不能把“中心法则”绝对化,遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究,为肿瘤的防治提供了新的线索。目前反转录酶已经成为研究这些学科的有力工具。

第76页：六、DNA的损伤修复♦DNA的损伤

六、DNA的损伤修复♦DNA的损伤:DNA在复制时产生错配、病毒基因整合,某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等,破坏DNA的双螺旋结构,从而影响DNA的复制,并使DNA的转录和翻译也跟着变化,因而表现出异常的特征(生物突变)。

♦若DNA的损伤或错配得不到修复,会导致DNA突变。

其主要形式:一个或几个碱基被置换插入一个或几个碱基一个或多个碱基对缺失♦DNA的损伤修复——5种修复途径: 错配修复、光复活修复、切除修复、重组修复和诱导修复(亦称暗修复)。

第77页：错配修复

其过程

:识别出不正确的链,切除掉不正确链的部分,然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用,合成正确配对的双链DNA

第78页：重组修复

起一系列复杂的诱导效应,

应急反应(SOSresponse)

第79页：相邻的胸腺嘧啶紫外线照射环丁烷胸腺嘧

相邻的胸腺嘧啶紫外线照射环丁烷胸腺嘧啶二聚体紫外线诱导嘧啶二聚体形成

第80页：

第81页：

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第83页：七、细菌的限制

双链DNA的核酸内切酶,

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease),可用于特异切割DNA,是很有用的工具酶

第84页：限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋

限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性。

限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。

5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—T A—A—C—3′3′—C—A—A T—T—G—5′平头末端HpaⅠ

第85页：5′

5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—G—3 ′ 5′—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—5 ′ 3′—G—5′粘性末端Eco RⅠ

第86页：八、基因重组与DNA“克隆”基因重组

八、基因重组与DNA“克隆”基因(DNA)重组DNA“克隆”质粒(plasmid):一种染色体外的、能独立复制的、小的环状DNA分子。

通常应用在基因工程中。

第87页：

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第91页：萤火虫的荧光素基因在烟草中表达人生长

萤火虫的荧光素基因在烟草中表达人生长素基因被导入并整合到右边小鼠的基因组番茄工程植株具有抗昆虫幼虫的能力

第92页：九、聚合酶链式反应技术与DNA扩增PCR

九、聚合酶链式反应(PCR)技术与DNA扩增PCR(polymerase Chain reaction)——聚合酶链式反应,也称体外酶促基因扩增,原理类似天然DNA复制。

靶DNA分子变性后解链,两条单链DNA分别与两条引物互补结合,在4种dNTP存在和合适的条件下,由耐热的TaqDNA聚合酶催化引物由5´→3´扩增延伸,形成两条新的双链DNA分子,并作为下一循环的模板。

每经过一个变性、复性、延伸循环,模板DNA增加一倍。经过30~50个循环, 可使原DNA量增加106~109倍。

第93页：

第94页：模板DNA的变性

模板DNA的变性:一般选用95℃左右1min,使DNA双链解为单链• 复性:按引物实际情况确定适当温度,时间一般30s至1.5min• 延伸:一般72℃ 1min• 循环数:按初始模板浓度确定, 一般25-45之间PCR的主要步骤:变性延伸复性循环PCR