页数：112页文件大小：1.04 MB来源： 生物化学ppt课件
本课件围绕遗传信息传递的第一环节展开，给出中心法则与DNA复制的一般规律，讲解大肠杆菌DNA聚合酶特性、复制起始与延伸、冈崎片段与半不连续复制、真核复制特点，并介绍DNA损伤的修复机制。
Chapter 11DNA Replication and Repair
教学要求：本节要点如下。
大肠杆菌遗传图谱参与复制的基因
1958年F.Crick提出中心法则A.以DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程B.以某一段DNA分子为模板，合成出对应的RNA分子的过程C.以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程中心法则揭示了遗传信息的传递方向
中心法则
中心法则
第一节DNA的复制一：本节要点如下。
Semi-conservative replication
1963年，Cairns：本节要点如下。
Semi-conservative replication
复制中的大肠杆菌染色体
2．复制起点、单位和方向⑴复制起点多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段富含A.T。环状DNA复制起点的确定方法：在一个生长的群体中，几乎所有的染色体都在复制过程中。
复制起点的确定
⑶复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。等速进行双向进行定点起始异速进行单向进行
复制的方向
3．复制方式⑴直线双向复制单点，双向，T7。多点，双向，真核染色体DNA。⑵θ型复制单向，双向（E.coli.）⑶滚环复制单链，环状，Φx174⑷D环复制线粒体，叶绿体⑸多复制叉复制E.coli.富营养时，采取多复制叉复制方式。E.coli.DNA复制速最快可达50000bp/min，完全复制需40min，富营养时，20min分裂。
复制方式-1
复制方式-2
复制方式-3
4.半不连续复制所有DNA聚会酶催化反应的方向是5’→3’1968年，发现冈崎片段。细菌长:1000-2000bp真核: 100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度
复制叉
DNA replication
1．反应必备条件⑴DNA模板(反转录时用RNA模板)⑵引物(DNA、RNA或蛋白质)⑶DNA聚合酶⑷4种dNTP⑸Mg2+
DNA链的延长反应
3．几种由DNA聚合酶催化的DNA合成反应
1．原核DNA聚合酶（E.coli.）⑴E.coli.DNApol.I单体酶，分子量103000，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNApol.Ⅰ催化活性：5’3’聚合活性3’5’外切活性5’3’外切活性
用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：大片段（Klenow）5’3’聚合活性3’5’外切活性小片段5’3’外切活性Klenow片段的用途：a.补齐DNA3’隐缩未端b.标记DNA片段未端c．cDNA合成第二链d．DNA测序
E.coli.DNA pol.Ⅲ
DNA pol.：本节要点如下。
⑷DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ1999年发现，参与DNA的错误倾向修复。当DNA受到严重损伤时，可诱导合成这2种酶。它们能使修复缺乏准确性。
真核生物DNA聚合酶：本节要点如下。
真核生物DNA聚合酶（续）：本节要点如下。
真核生物DNA聚合酶（续）：本节要点如下。
真核生物DNA聚合酶（续）：本节要点如下。
DNA连接酶（ligase）
1.DNA合成的起始起始阶段是复制调节的唯一阶段。E.coli.DNA复制起点（oriC），由245bp组成。在5’端有3个13bp重序列，在3’端有4个9bp重复序列。
大肠杆菌DNA复制起点
复制的起始
复制的起始
大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质
大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质功能：DnaA在原点特定位置打开双螺旋DnaB使DNA解旋DnaCDnaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶（DNaG）合成RNA引物SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DnaA活性旋转酶松驰DNA扭曲应力
20个DnaA结合在四组9bp：本节要点如下。
3．RNA引物的切除及缺口补齐DNApolⅠ的5’3’外切活力，切除RNA引物。DNApolⅠ的5’3’聚合活性补齐缺口。
DNA链的延长反应前导链只需要一（续）：本节要点如下。
DNA复制小结：⑴：本节要点如下。
DNA复制过程中，聚合酶对dTTP与dUTP的分辨能力不高，有少量dUTP掺入DNA链中。此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNApolⅠ、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。
五、真核生物DNA的复制真核生物DNA复制叉移动的速度比原核的慢，如哺乳动物复制叉的移动速度每分钟1000-3000bp，细菌的每分钟50000bp。真核生物染色体全部复制完成前，起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。
真核生物在快速生长时，可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇，早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9kb，而在培养的成体细胞中，平均距离为40kb，成体细胞只利用一部分复制起点。
1．复制过程中组蛋白的装配核小体的结构（200bp左右）真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个打开，组蛋白八聚体直接转移到子代前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。DNA是半保留复制，组蛋白全保留。
复制时组蛋白的分布
端粒（telomeres）分布于真核染色体未端。酵母端粒约100bp的重复序列，形式为：5，（TxGy）n3，（AxCy）nx和y一般为1-4端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。
端粒酶含有RNA和蛋白质：本节要点如下。
人类体细胞的端粒长度，随年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次，端粒缩短50-200bp，短至1-4Kbp时，细胞就停止分裂。若能重建端粒，则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达量多。
六、DNA复制的真实性体内DNA复制具有高度真实性，每复制107-1011个碱基对出现一个错误。碱基对的自由能在4-13KJ/mol，相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10-2。
1．DNA聚合酶的碱基选择作用酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP停留时间长，而参与聚合。酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。DNA聚合酶能根据模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。
2．3’→5’外切活性：本节要点如下。
影响DNA合成真实性的因素：本节要点如下。
4．用RNA引物⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配。⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的3’→5’校对功能难发挥作用。
第二节DNA的损伤及修复紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。
胸腺嘧啶二聚体
一、光修复1949年已发现光复活象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。A.形成嘧啶二聚体B.光复合酶结合于损伤部位C.酶被可见光激活D.修复后释放酶
光修复
二、切除修复在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常功能。A.核酸内切酶识别DNA损伤部位，并在附近将其切开B.核酸外切酶切除损伤的DNAC.DNA聚合酶修复D. DNA连接酶连接
甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β-糖苷键，产生脱嘌呤作用。DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。
三、重组修复切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。
重组修复
四、诱导修复和应急反应
第三节RNA指导DNA的合成反转录：本节要点如下。
放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV），证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的。
一、反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。A.RNA指导DNA合成B.DNA指导DNA合成C.RNaseH酶活力水解RNA-DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用
以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶反转录酶的活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA，都能作为合成DNA的模板。引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+真核mRNA3’端有poly A，加入Oligo dT后，成为反转录酶的模板，可合成cDNA。
反转录病毒
二、病毒RNA的反转录反转录病毒：本节要点如下。
2．反转录病毒的生活周期
三、反转录的生物学意义：本节要点如下。
HIV-1（Human immunodeficiency virus）
4.两种病毒的区别
不均一性在1~5%的mRNA中，有10000-30000mRNA种。分离、纯化用OligodT纤维素柱（亲和层析法），加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA。降低盐浓度，加入OligodT竞争，可洗出mRNA混合物。免疫法可分离特定的mRNA
②cDNA合成A.自身引物法（S1核酸酶降解法）Oligo(dT)15-18个核苷酸mRNA5’端序列有丢失
B.取代合成法（较常用）Oliyo（dT）与mRNA3’端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。RNaseH在mRNA上产生多个切口。DNApol.Ⅰ切口平移，DNAligase连接，合成出第二条DNA链。T4DNApol.切去端头的RNA-DNA杂交链。
取代合成法
C.引物合成法可以合成全长cDNA：本节要点如下。
获取特定mRNA的cDNA：本节要点如下。
二.PCR技术（聚合酶链式原应）PolymerasechainReaction以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及TaqDNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。
反应物：本节要点如下。
TaqDNA聚合酶有很好的热稳定性：本节要点如下。
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