01 Protein.pptx

第1页：Chapter 1 Protein

Chapter 1 Protein

第2页：Some functions of proteins

Some functions of proteins(a)Fireflies-luciferase(b) Erythrocytes-hemoglobin(c) Vertebrates-keratin（hair、horn、wool、nails and feathers）

第3页：主要内容氨基酸Amino acid

主要内容氨基酸Amino acid：本节要点如下。

• 蛋白质的一级结构Primary structure
• 蛋白质的空间结构Three-dimensional structure
• 蛋白质的结构与功能Function
• 蛋白质的分离和纯化Isolation and purification

第4页：基本要求

基本要求：本节要点如下。

• 1.了解蛋白质分类、组成、主要功能
• 2.掌握20种氨基酸的结构特点
• 3.掌握氨基酸的理化性质（解离、化学反应）
• 4.掌握蛋白质的结构层次

第5页：基本要求（续）

基本要求（续）：本节要点如下。

• 5.了解一级结构测定方法
• 6.理解一级结构、空间结构与功能的关系
• 7.掌握蛋白质的胶体性质、沉淀与变性
• 8.掌握分离纯化蛋白质的原理和方法

第6页：第一节蛋白质结构单元-氨基酸Amino

第一节蛋白质结构单元-氨基酸Amino acid

第7页：Building blocks of

Building blocks of proteins

第8页：一、蛋白质的化学组成和分类

一、蛋白质的化学组成和分类：本节要点如下。

• 1.凯氏（Kjedahl）定氮法-测定粗蛋白含量N 16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.252.简单蛋白和缀合蛋白simple proteinconjugated protein（P15，Table 2-1）
• 3.根据蛋白质功能分类（P72）

第9页：二、蛋白质的水解

酸水解

6.0 mol/L HCl or 4.0 mol/L H2SO4色氨酸分解，丝氨酸和苏氨酸部分分解，天冬酰胺和谷氨酰胺转化。

碱水解

5.0 mol/L NaOH，多数氨基酸破坏，产生消旋，色氨酸稳定

酶水解

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶

第10页：Hydrolysisofprotein

Hydrolysisofprotein

第11页：三、α-氨基酸的结构-兼性离子

三、α-氨基酸的结构-兼性离子

第12页：四、氨基酸的分类

四、氨基酸的分类：本节要点如下。

• 1.基本氨基酸（20种）有遗传密码，构成蛋白质（P17，表2-2）。
• 2.修饰后的蛋白质氨基酸（无遗传密码）化学修饰产生（4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸）
• 3.非蛋白质氨基酸不存在于蛋白质中，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸

第13页：

第14页：20种基本氨基酸的结构特征

20种基本氨基酸的结构特征

第15页：A. R基非极性、脂肪族氨基酸

A. R基非极性、脂肪族氨基酸

第16页：侧链是中性烷基，等电点非常接近

侧链是中性烷基，等电点非常接近：本节要点如下。

• ②从Gly到Ile，疏水性增加。
• ③一般位于蛋白质分子内部，侧链不被修饰
• ④Pro的α-氨基成环，在蛋白质空间结构中具有重要的作用。
• ⑤Met含有甲硫基（-S-CH3），是重要的甲基供体，合成乙酰胆碱和乙烯。

第17页：B. R基极性、不带电荷氨基酸

B. R基极性、不带电荷氨基酸

第18页：Ser的-OH是极性基团，易形成氢键

Ser的-OH是极性基团，易形成氢键：本节要点如下。

• ②Thr的-OH是仲醇，具有亲水性，形成氢键的能力较弱。
• ③Cys含巯基，2个Cys形成二硫键，利于稳定蛋白质结构。

第19页：二硫键的形成

二硫键的形成

第20页：Asn

Asn：本节要点如下。

• 和Gln
• 易发生氨基转移反应，在氨基酸代谢中具有重要意义。

第21页：C. R基芳香族氨基酸

C. R基芳香族氨基酸

第22页：含有共轭π电子

含有共轭π电子，易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)，在生物大分子的相互识别过程中具有重要作用。这3种氨基酸在紫外区有特定的吸收峰。

第23页：D. R基带正电荷氨基酸

D. R基带正电荷氨基酸

第24页：Lys侧链氨基pKa是10.53

Lys侧链氨基pKa是10.53：本节要点如下。

• ②Arg是碱性最强的氨基酸，pKa是12.48，生理条件下完全质子化。
• ③His的咪唑基pKa在游离氨基酸中是6.00，在多肽链中是7.35；在20种氨基酸中，His侧链pKa值最接近生理pH，具有缓冲能力。

第25页：E. R基带负电荷氨基酸

E. R基带负电荷氨基酸

第26页：Asp

Asp：本节要点如下。

• 侧链羧基pKa（β-COOH）是3.86Glu
• 侧链羧基pKa（γ-COOH）是4.25它们在生理条件下带负电荷。

第27页：五、氨基酸的酸碱性质

五、氨基酸的酸碱性质：本节要点如下。

• ①晶体溶点高，离子晶体
• ②不溶于非极性溶剂
• ③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，乙醇、丙酮使水的介电常数降低），水溶液中的氨基酸是极性分子

第28页：氨基酸在水溶液中以两性离子形式存在

氨基酸在水溶液中以两性离子形式存在

α-羧基pK约2.0，pH>3.5时，α-羧基存在形式-COO-α-氨基pK约9.4，pH<8.0时，α-氨基存在形式-NH+3当pH3.5-8.0，两性离子形式存在。

第29页：氨基酸两性离子

氨基酸两性离子

第30页：氨基酸的解离

氨基酸的解离

第31页：酸碱滴定曲线

2.酸碱滴定曲线（Titration）Gly解离和滴定曲线

第32页：起点：100%Gly+净电荷

起点

100%Gly+净电荷：+1第一拐点：50%Gly+和50%Gly±净电荷：+0.5pH=pK1+lg[Gly±]/[Gly+]=pK1=2.34第二拐点：100%Gly±净电荷：0等电点pI=5.97第三拐点：50%Gly±和50%Gly-净电荷：-0.5pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6终点：100%Gly-净电荷：-1

第33页：Gly的等电点

Gly的等电点（Isoelectricpoint）pI

第34页：

第35页：在等电点pH时，氨基酸溶解度最小

在等电点pH时，氨基酸溶解度最小。pH>pI时，带负电荷pH=pI时，净电荷为零pH<pI时，带正电荷以Gly为例pH<2.34正+1.0～+0.5pH=2.34正+0.52.34<pH<5.97正0.5～05.97<pH<9.60负0～-0.5pH>9.60负-0.5～-1.0

第36页：Glu解离和滴定曲线

Glu解离和滴定曲线

第37页：His解离和滴定曲线

His解离和滴定曲线

第38页：要点

要点：本节要点如下。

• （1）pH=pK，缓冲能力最大
• （2）氨基酸pI的计算
• （3）不同pH时的电泳行为pH>pI时，向正极移动pH=pI时，净电荷为零pH<pI时，向负极移动

第39页：举例Glu解离常数pK1α-COOH2.

举例Glu解离常数pK1α-COOH2.：本节要点如下。

• ①绘出滴定曲线
• ②Glu-和Glu=各一半时的pH值
• ③Glu带正电荷的pH范围
• ④Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围

第40页：Glu滴定曲线Glu+Glu+-Glu-

Glu滴定曲线Glu+Glu+-Glu-Glu--

第41页：解答

解答：本节要点如下。

• ①见上图
• ②Glu-和Glu=各50%时，pH＝9.67
• ③pH<3.22时，Glu带正电荷
• ④Glu±和Glu-缓冲范围在pH4.25左右

第42页：六、氨基酸的化学性质

酰化反应酰化试剂

酰氯、酸酐对-甲苯磺酰氯在多肽成中用作氨基保护剂丹磺酰氯（5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯）

第43页：与丹磺酰氯反应

与丹磺酰氯反应

第44页：DNS-Cl

可用于多肽链N端氨基酸的标记Gly－

可用于多肽链N端氨基酸的标记Gly－Ala－Ser－Leu－PheDNS－Gly－Ala－Ser－Leu－Phe

水解产物

DNS－Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-氨基酸被紫外光激发后发黄绿色荧光

第45页：烷基化反应α-氨基氮是一个亲核中心

2.烷基化反应α-氨基氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应A.2.4－二硝基氟苯反应（DNFB、FDNB）Sanger反应

第46页：二硝基苯基氨基酸

二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）呈黄色，可以用层析法鉴定。Sanger用此反应来测定蛋白质的N末端氨基酸。

第47页：B.异硫氰酸苯酯反应

B.异硫氰酸苯酯反应（PTCEdman反应）

第48页：PTH-氨基酸，无色

PTH-氨基酸，无色：本节要点如下。

• 用此反应来鉴定protein
• 的N末端氨基酸现用于蛋白质序列分析。

第49页：生成西佛碱的反应

3.生成西佛碱的反应（Schiff）α氨基与醛类反应，生成西佛碱转氨基反应

第50页：α-羧基参加的反应

α-羧基参加的反应：本节要点如下。

• 1.成盐、成酯分别与碱、醇反应
• 2.成酰氯的反应（使羧基活化）氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯。此反应使氨基酸的羧基活化，易与另一个氨基酸的氨基结合，常用于多肽合成。

第51页：α-NH2和α-COOH共同参加的反应

1.与茚三酮反应在弱酸中α-氨基酸与茚三酮共热，氨基酸氧化脱氨、脱羧，生成还原茚三酮。茚三酮再与反应产物（还原茚三酮和氨）反应，生成紫色化合物。λmax=570nm，Proλmax=440nm，此反应用于氨基酸定量分析。

第52页：氨基酸与茚三酮反应水合茚三酮+氨基酸

氨基酸与茚三酮反应水合茚三酮+氨基酸

第53页：侧链R基参与的反应用于蛋白质的化学修饰

（四）侧链R基参与的反应用于蛋白质的化学修饰

第54页：ConfigurationGly

ConfigurationGly：本节要点如下。

• 只有一种构型，无旋光性Thr
• 和Ile
• 各有四种光学异构体其余氨基酸有两种光学异构体：L型、D型构成protein
• 的氨基酸均属L-型七、氨基酸的旋光性和吸光性

第55页：氨基酸的构型

氨基酸的构型

第56页：苏氨酸的构型

苏氨酸的构型

第57页：旋光性Gly无旋光性外消旋物

旋光性Gly无旋光性外消旋物

D-型和L-型的等摩尔混合物（L-苏氨酸和D-苏氨酸）内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸

第58页：内消旋胱氨酸

内消旋胱氨酸

第59页：氨基酸的光吸收性

3.氨基酸的光吸收性

第60页：芳香族氨基酸的紫外吸收

芳香族氨基酸的紫外吸收：下表列出相关数据。

第61页：氨基酸的吸收光谱

氨基酸的吸收光谱

第62页：氨基酸的等电点（pI）

氨基酸的等电点（pI）：下表列出相关数据。

第63页：氨基酸电泳

氨基酸电泳

第64页：垂直电泳槽

垂直电泳槽

第65页：色谱法

2.色谱法（chromatography）（层析法）原理

第66页：色谱法

色谱法：本节要点如下。

• 固定相
• 流动相
• 柱层析、薄层层析、纸层析
• 色谱柱（层析柱）
• 固定相（填料）
• 流动相（洗脱剂）
• 分配系数
• 塔板理论
• 洗脱曲线

第67页：离子交换层析分离

3.离子交换层析分离氨基酸磺酸型阳离子交换树脂，基质－聚苯乙烯

第68页：树脂用含Na＋的缓冲液平衡，pH＝2

树脂用含Na＋的缓冲液平衡，pH＝2；氨基酸混合溶液pH 2-3，都是阳离子。作用力：静电吸引，氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力洗脱液：pH逐渐升高盐离子（Na＋）浓度逐渐升高

第69页：

第70页：氨基酸分析原理

氨基酸分析原理

第71页：氨基酸分析图谱

氨基酸分析图谱

第72页：第二节蛋白质的通性、纯化和表征

第二节蛋白质的通性、纯化和表征：本节要点如下。

• P30-42
• 自学
• 课堂讨论

第73页：第三节蛋白质的共价结构蛋白质分子大小

第三节蛋白质的共价结构蛋白质分子大小、蛋白质结构的层次、蛋白质一级结构测定、肽、多肽的化学合成

第74页：一、蛋白质分子大小和形状蛋白质

一、蛋白质分子大小和形状蛋白质

氨基酸数量大于50肽：氨基酸数量小于50蛋白质的分子量=氨基酸数量×110（氨基酸平均分子量138，加权平均128，扣除水分子。）P43，表4-1，蛋白质分子大小。

第75页：

第76页：分子形状globular protein:分子对称

分子形状globular protein:分子对称，接近球状，溶解度高，能结晶，大多数蛋白质属此类。fibrous protein：轴比大于10，对称性差，细棒状或纤维状。

第77页：二、蛋白质的构象与结构

二、蛋白质的构象与结构层次每一种天然蛋白质都有特定的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的天然构象（nativeconformation）。

第78页：蛋白质的结构层次

蛋白质的结构层次

第79页：一级结构：分子中氨基酸的排列顺序

一级结构

分子中氨基酸的排列顺序，包括二硫键。（全部共价结构）二级结构：多肽链借助氢键排列成的α-螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲。

第80页：一级结构

一级结构（primary structure）

第81页：二级结构

二级结构（secondary structure）α螺旋、β折叠、β转角

第82页：β转角

β转角

第83页：三级结构：多肽链通过盘旋、折叠

三级结构

多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的依靠各种次级键维持的球状构象。α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段的组合。

第84页：四级结构：具有三级结构

四级结构

具有三级结构的亚基借助非共价力形成多聚体。

第85页：三、肽peptide

三、肽peptide（一）肽和肽键一个氨基酸的α羧基和另一个氨基酸的α氨基脱水缩合而成的化合物。肽键：氨基酸间脱水后形成的酰氨键。两个氨基酸组成的肽－二肽少于10个氨基酸的肽－寡肽多于10个氨基酸的肽－多肽

第86页：氨基酸缩合

氨基酸缩合

第87页：五肽结构

五肽结构

第88页：名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸写法

名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸写法：本节要点如下。

• 或SGYAL如果倒过来写，则表示完全不同的肽例如：Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser
• 或LAYGS

第89页：肽键的结构特点

肽键的结构特点（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体。

第90页：酰胺平面

酰胺平面

第91页：肽键具有部分双键性质

肽键具有部分双键性质：本节要点如下。

• （3）肽键亚氨基在pH0～14内不解离
• （4）肽链中的肽键一般是反式构型，Pro的肽键可能出现顺式和反式构型。

第92页：肽的重要性质

肽的重要性质：本节要点如下。

• 1.旋光性短肽的比旋光度等于其各个氨基酸的旋光度之和。
• 2.酸碱性质肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链基团，在多肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。

第93页：肽或蛋白质中可解离的基团

肽或蛋白质中可解离的基团

第94页：肽的化学反应α-羧基

3.肽的化学反应α-羧基、α-氨基和侧链上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的化学反应。凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定性、定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应，CuSO4与双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色化合物。

第95页：双缩脲反应-1

双缩脲反应-1

第96页：双缩脲反应-2

双缩脲反应-2

第97页：天然存在的活性肽活性肽

1.谷胱甘肽Glu－Cys－Gly参与细胞内氧化还原反应，清除过氧化物和自由基，保持酶活性中心的巯基处于还原状态。H2O2+2GSH2H2O+GS－SG

第98页：天然存在的活性肽活性肽（续）

天然存在的活性肽活性肽（续）：本节要点如下。

• 2.短杆菌肽（抗生素）环状10肽，抗菌。L-Orn－L-Leu－D-Phe－L-Pro－L-Val－L-Orn－L-Leu－D-Phe－L-Pro－L-ValOrn－鸟氨酸
• 3.脑啡肽（5肽，镇痛，已发现几十种）Met－脑啡肽：Tyr－Gly－Gly－Phe－MetLeu－脑啡肽：Tyr－Gly－Gly－Phe－LeuLeu－脑啡肽，镇痛，不成瘾。

第99页：

第100页：生物体内寡肽或多肽的来源A.蛋白质合成

生物体内寡肽或多肽的来源A.蛋白质合成后的剪切、修饰B.酶逐步合成（如谷胱甘肽）C.动物肠道可吸收寡肽

第101页：四、蛋白质测序（自学+讨论）意义

四、蛋白质测序（自学+讨论）意义

一级结构（序列）中含有形成高级结构全部必需的信息，一级结构决定高级结构及功能。推断氨基酸序列（一级结构）空间结构预测空间结构（高级结构）蛋白质功能

第102页：测序的步骤

测序的步骤：本节要点如下。

• 1.测定多肽链的数目
• 2.拆分多肽链
• 3.测定氨基酸组成
• 4.断裂链内二硫键
• 5.分析多肽链的N末端和C末端
• 6.多肽链部分裂解成肽段
• 7.测定各个肽段的氨基酸顺序
• 8.确定肽段在多肽链中的顺序
• 9.确定多肽链中二硫键的位置

第103页：protein测序的基本策略理想的方法

直接法

1.直接法（测protein序列）两种以上特异性裂解法：NCA法裂解A1A2A3A4B法裂解B1B2B3B

间接法

测定核酸序列，推断蛋白质序列

第104页：测序前的准备工作

纯度及均一性鉴定要求

纯度97%以上，均一。两种以上纯度鉴定方法才可靠⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）要求一条带⑵DNS-Cl测N端氨基酸

测定分子量用于估算氨基酸残基数n=M/110方法

2.测定分子量用于估算氨基酸残基数n=M/110方法：SDS-PAGE、凝胶过滤法沉降系数法、渗透压法

第105页：SDS-PAGESDSpolyacryl

SDS-PAGESDSpolyacrylamidegelelectrophoresis

第106页：

第107页：

第108页：凝胶过滤层析

凝胶过滤层析（Gel filtration）

第109页：确定亚基种类及数目⑴拆离四级结构

M2两条电泳带拆二硫键

M

M2两条电泳带分子量关系

M=2M1+2M2

第110页：测定氨基酸组成酸水解或碱水解

4.测定氨基酸组成酸水解或碱水解，确定肽链中各种氨基酸出现的频率，便于选择裂解方法及试剂。

第111页：测定氨基酸组成酸水解或碱水解（续）

测定氨基酸组成酸水解或碱水解（续）：本节要点如下。

• 5.端基分析①N端分析DNS-Cl
• 法：黄绿色荧光，灵敏度高薄层层析，方法简便DNFB法：Sanger
• 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，液相色谱等PITC法：Edman
• 法，逐步切下，无色PTH-氨基酸，液相色谱分析。

第112页：C端分析A．肼解法H2N-A-B-C-D

C端分析A．肼解法H2N-A-B-C-D：本节要点如下。

• 2、B-NHNH2C-NHNH
• 2、D-COOH氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此方法

第113页：肼解法测定C末端

肼解法测定C末端

第114页：B．羧肽酶法

不能用此方法）羧肽酶A

除Pro、Arg、Lys

外的所有C端氨基酸羧肽酶B

只水解Arg、LysH2N……………Val－Ser－Gly

第115页：肽链的部分裂解和肽段的分离纯化

肽链的部分裂解和肽段的分离纯化：本节要点如下。

• ①溴化氰－Met－X－产率85%
• ②亚碘酰基苯甲酸－Trp－X－产率70-100%
• ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）－X－Cys－
• ④羟胺NH2OH－Asn－Gly－约150个氨基酸出现一次

第116页：酶法裂解

酶法裂解：本节要点如下。

• ①胰蛋白酶Lys-X（X≠Pro），Arg-X
• ②胰凝乳蛋白酶Tyr-X（X≠Pro）Trp-X，Phe-X
• ③胃蛋白酶Phe（Trp、Tyr、Leu）-Phe（Trp、Tyr、Leu）
• ③Glu蛋白酶Glu-X
• ④Arg蛋白酶Arg-X
• ⑤Lys蛋白酶X-Lys
• ⑥Pro蛋白酶Pro-X

第117页：酶法裂解（续）

酶法裂解（续）：本节要点如下。

• 3.肽段的分离纯化
• ①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离
• ②离子交换层析法（DEAE－Cellulose、DEAE－Sephadex）根据肽段的电荷特性分离
• ③反相ＨＰＬＣ法（C18柱）根据肽段的极性分离
• ④凝胶过滤根据分子量大小分离

第118页：酶法裂解（续）

4.肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度。可用ＤＮＳ-Cl法要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带ＨＰＬＣ单峰Ｎ端单一

第119页：肽段的序列测定及肽链的拼接

肽段的序列测定及肽链的拼接：本节要点如下。

• （1）耦联PITC＋H２N－A-B-C-DpH8-9，40℃，PTC－A-B-C-D
• （2）裂解PTC－A-B-C-D+TFA无水三氟乙ATZ－A+H2N－B-C-D
• （3）转化ATZ－APTH－APTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（-氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（-氨基酸）

第120页：DNS-Edman法用DNS法测N末端

3.有色Edman法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂

第121页：DNS-Edman法用DNS法测（续）

自动序列分析仪测序仪器原理

Edman

法，可测60－70肽1967液相测序仪，自旋反应器

法，可测60－70肽1967液相测序仪，自旋反应器，适于大肽段1971固相测序仪，表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端1981气相测序仪，用Polybrene

反应器（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相

5nmol20－40肽97%气相：5pmol60肽98%

第122页：DNS-Edman法用DNS法测（续）

5.肽段拼接成肽链16肽，N端H，Ｃ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWTＢ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS

第123页：二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定

1.二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭－SH胃蛋白酶酶解protein第一向电泳过甲酸氧化－S－S－生成－SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置

第124页：

第125页：

第126页：二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定（续）

2.酰胺的确定Asp－Asn、Glu－Gln酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0时，电荷量是Leu+Pro0Val-此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln

第127页：二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定（续）

糖、脂、磷酸基团位置的确定糖通过Asn

3.糖、脂、磷酸基团位置的确定糖通过Asn、Ser

与protein

与protein

连接，生成-N-糖苷或-0-糖苷脂类

Ser、Thr、Cys

磷酸

Ser、Thr、His

经验序列

Lys（Arg）-Ser-Asn-Ser（PO4）Arg-Thr-Leu-Ser（PO4）Lys（Arg）-Ala-Ser（PO4）

第128页：四、蛋白质一级结构

四、蛋白质一级结构举例胰岛素RNA酶血红蛋白

第129页：51个氨基酸，A链21，B链30

51个氨基酸，A链21，B链30。A链内有1个二硫键Cys6—Cys11A.B链间有2个二硫键A.Cys7—B.Cys7A.Cys20—B.Cys19分子量：5700dalton

第130页：RNase

RNase

第131页：124个氨基酸残基4个链内二硫键分子量

124个氨基酸残基4个链内二硫键分子量：12600牛胰RNase变性－复性实验

第132页：五、蛋白质序列数据库蛋白质序列

五、蛋白质序列数据库蛋白质序列可以从核苷酸序列翻译得到。PIR（ProteinInformationResource）GenBank（GeneSequenceDataBank）EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank）蛋白质数量4200万，约50%确定了功能。

第133页：六、多肽与蛋白质的化学合成

六、多肽与蛋白质的化学合成：本节要点如下。

• 氨基用Fmoc
• 保护羧基用二环己基碳二亚胺（DCC）活化C端→N端挂接→去保护→中和→缩合→（去保护→中和→缩合）n→多肽

第134页：Fmoc

Fmoc（fluorenylmeth-yloxycarbonyl）9-芴甲基氧基甲酰氯，保护氨基

第135页：蛋白质的固相合成聚苯乙烯二环己基碳二亚胺

蛋白质的固相合成聚苯乙烯二环己基碳二亚胺

第136页：

第137页：第四节蛋白质的三维结构

第四节蛋白质的三维结构生物体内的蛋白质只有一种或少数几种热力学上最稳定的构象，具有生物活性，称为天然构象（native protein）。

第138页：一、蛋白质构象研究方法

一、蛋白质构象研究方法：本节要点如下。

• X射线衍射
• 核磁共振
• 圆二色性
• 荧光偏振
• 拉曼光谱
• 扫描隧道显微术

第139页：二、稳定蛋白质三维结构的作用力

二、稳定蛋白质三维结构的作用力：本节要点如下。

• 疏水作用力-暴露在溶剂中的疏水基团尽可能少，多肽链和周围水分子形成的氢键处在最有利能量状态。
• 熵效应-蛋白质折叠的热力学驱动力
• 氢键、离子键、二硫键的形成也是由熵效应驱动的
• 蛋白质分子中的疏水残基和亲水残基

第140页：三、肽链的折叠的空间限制

1.肽链的二面角（dihedral angle）

第141页：

第142页：C2α原子有两个单键，能自由旋转

C2α原子有两个单键，能自由旋转。绕C2α－N2键旋转的角度为Φ。绕C2α－C2键旋转的角度称Ψ。

第143页：旋转Φ使得C1-N2和C2α-C2呈顺式

旋转Φ使得C1-N2和C2α-C2呈顺式，Φ=0°旋转Ψ使得N3-C2和N2-C2α呈顺式，Ψ=0°从C2α向N2方向看，顺时针旋转C2α-N2键Φ角为正值，反之为负值。从C2α向C2方向看，顺时针旋转C2α-C2键Ψ角为正值，反之为负值。

第144页：多肽链折叠的空间限制Φ和Ψ同时为0

2.多肽链折叠的空间限制Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在。二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性也影响Φ和Ψ。

第145页：拉氏构象图根据蛋白质中间的最小接触距离

拉氏构象图根据蛋白质中间的最小接触距离，可以确定二面角（Φ、Ψ）的存在区域。以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在图上标出二面角（Φ、Ψ）可能存在的区域，该图称拉氏构象图。

第146页：拉氏构象图

拉氏构象图

第147页：拉氏构象图

拉氏构象图

第148页：α螺旋（αhelix）特征：多肽主链盘绕

α螺旋（αhelix）特征

多肽主链盘绕，形成右手或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都有相同的二面角。四、二级结构-多肽链的局部规则构象

第149页：α螺旋

α螺旋

第150页：α-螺旋截面

α-螺旋截面

第151页：

第152页：α螺旋

α螺旋（3.613）特征A.Φ=-57°,Ψ=-48°，右手螺旋B.每圈3.6个氨基酸，高度0.54nmC.每个氨基酸绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nmD.氨基酸侧链向外E.相邻螺圈间形成氢链，取向与中心轴平行F.C=0氧与它后面第4个残基的N-H氢形成氢键

第153页：典型的α螺旋用3.613表示

典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个氨基酸，13表示氢键封闭的环包括13个原子。此外，还有2.27螺旋，310螺旋，4.316螺旋

第154页：2.27螺旋、310螺旋

2.27螺旋、310螺旋、3.613螺旋、4.316螺旋

第155页：

第156页：右手α螺旋与左手α螺旋右手螺旋比左手螺旋

右手α螺旋与左手α螺旋右手螺旋比左手螺旋稳定蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋。例外：嗜热菌蛋白酶中有一段很短的左手α螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）

第157页：

第158页：β折叠

2.β折叠（βpleatedsheet）

第159页：β折叠

β折叠

第160页：两条或多条伸展的多肽链侧向聚集

两条或多条伸展的多肽链侧向聚集，相邻主链上的N-H和C=0之间形成氢链，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。Parallel：β-折叠肽链的N端在同一侧φ=-119°，Ψ=+113°Antiparallel：φ=-139°，Ψ=+135°

第161页：纤维状蛋白质中

纤维状蛋白质中，β折叠主要是反平行式，球状蛋白质中两种方式都存在。在纤维状蛋白质的β折叠中，氢键主要是在肽链之间形成；而在球状蛋白质中，β折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分之间形成。

第162页：β-turn

3.β转角（β turn）

第163页：特征：A.4个连续的氨基酸组成

特征

A.4个连续的氨基酸组成B.主链骨架180°折叠C.第一个氨基酸的C=O与第四个氨基酸的N-H形成氢键D.C1α与C4α之间距离小于0.7nmE.多数由亲水氨基酸组成

第164页：无规则卷曲

4.无规则卷曲（randomcoil）没有规律的多肽链主链骨架构象，往往与生物活性有关。α螺旋、β折叠在拉氏构象图上有固定的位置，无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。

第165页：五、纤维状蛋白质由单一类型的二级结构组成

1.角蛋白源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物，可分成α角蛋白和β角蛋白。

第166页：α角蛋白（毛发）由α-螺旋组成

（1）α角蛋白（毛发）由α-螺旋组成，2股右手α-螺旋向左缠绕成双螺旋，2个双螺旋缠绕成原纤丝，4个双螺旋缠绕成初原纤丝。Cys含量较高，二硫键保证结构稳定性。α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象。

第167页：

第168页：α角蛋白

α角蛋白

第169页：烫发

烫发

第170页：β角蛋白

（2）β角蛋白（丝心蛋白）以β折叠结构为主反平行式β折叠片的堆积，链间主要以氢键结合，层间主要靠范德华力维持，富含Gly、Ala、Ser。

第171页：丝心蛋白

丝心蛋白

第172页：胶原蛋白

胶原蛋白：本节要点如下。

• 3.弹性蛋白
• 4.肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白

第173页：六、超二级结构和结构域

1.超二级结构若干个相邻的二级结构单元相互作用，形成稳定的、有规则的二级结构组合体。A.αα结构由2股或3股右手α螺旋缠绕形成的左手螺旋，存在于α角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋和纤维蛋白原中。

第174页：B.βαβ结构2

B.βαβ结构2个平行β折叠通过一段α螺旋连接而形成的超二级结构。苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶。

第175页：蛋白质超二级结构

蛋白质超二级结构

第176页：

第177页：

第178页：结构域

2.结构域（domain）在二级结构和超二级结构的基础上，多肽链进一步折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。A.结构域是球状蛋白的折叠单位B.较小的蛋白质分子或亚基通常是单结构域C.结构域一般有100－200氨基酸残基

第179页：D.结构域之间常常有一段柔性的肽段相连

D.结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。E.结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。F.结构域间的裂缝常是酶的活性部位，也是反应物的出入口。

第180页：七、球状蛋白质与三级结构

七、球状蛋白质与三级结构：本节要点如下。

• 蛋白质一级结构决定高级结构
• 二级结构由短程顺序决定，当相邻氨基酸有适当的顺序时，能自发形成α螺旋和β折叠，并处于稳定状态。
• 三级结构由长程顺序决定，某些氨基酸的位置决定多肽链转弯的方向和角度。

第181页：球状蛋白质

1.球状蛋白质

第182页：

第183页：

第184页：

第185页：球状蛋白质（续）

2.球状蛋白质的三维结构多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的空间结构。结构特点：A.含有多种二级结构B.折叠层次分明，二级、超二级、结构域、三级C.相对紧密的球体D.疏水氨基酸在内部E.分子表面有裂隙

第186页：维持三级结构的作用

维持三级结构的作用力A.氢键B.范德华力（分子间及基团间作用力）定向效应，诱导效应，色散效应C.疏水作用力D.离子键、配位键E.二硫键二硫键不指导多肽链的折叠，但是可以稳定三级结构。

第187页：维持三级结构的作用力

维持三级结构的作用力

第188页：

第189页：八、亚基缔合与蛋白质四级结构四级结构

八、亚基缔合与蛋白质四级结构四级结构

多个具有三级结构的亚基，通过非共价键聚集形成特定的空间结构。举例：P67表5-2维持四级结构的作用力：氢键、疏水作用、离子键

第190页：

第191页：多个亚基聚集成四级结构的优势

多个亚基聚集成四级结构的优势

A.稳定性增强（比表面积减小）B.提高遗传经济性C.提高催化效率（各种酶分子聚集）D.活性可调节（别构效应）

第192页：九、蛋白质的变性与折叠

1.蛋白质变性物理、化学因素使蛋白质从有序紧密的结构变为无序松散的结构。因素：强酸、强碱有机溶剂去污剂还原剂（-硫基乙醇）盐析、盐溶重金属离子温度机械力（搅拌、研磨）

第193页：蛋白质变性引起的性质变化

蛋白质变性引起的性质变化：本节要点如下。

• ①结晶性和生物活性丧失
• ②疏水基团外露，分子结构伸展
• ③溶解度降低，易沉淀，粘度增加
• 易被蛋白酶水解实际应用A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温B.提取活性蛋白质时防止蛋白质变性

第194页：可逆变性与不可逆变性三级

可逆变性与不可逆变性三级（或四级）结构被破坏时，通常引起可逆变性。二级及三级（或四级）结构同时被破坏，通常引起不可逆变性。蛋白质复性

第195页：氨基酸序列决定蛋白质的高级结构

2.氨基酸序列决定蛋白质的高级结构RNA酶变性实验

第196页：牛胰RNA酶变性

牛胰RNA酶变性、复性实验8M尿素+β硫基乙醇→变性、失活→透析后活性恢复95%以上若二硫键随机形成，正确复性的概率是：1/105（1/7，1/5，1/3）

第197页：蛋白质折叠

蛋白质折叠：本节要点如下。

• Anfinses实验-热力学稳定
• Levinthal疑题
• 熔球模型线状分子→局部二级结构→超二级结构→结构域→熔球→构象调整→三级结构

第198页：

第199页：参与蛋白质折叠的辅助因子

参与蛋白质折叠的辅助因子：本节要点如下。

• 分子伴侣（molecular chaperone）Hsp70（heat shock protein，热休克蛋白）Hsp60
• 异构酶（isomerase）蛋白质二硫键异构酶---二硫键重组肽脯氨酰异构酶---脯氨酸肽键顺、反异构

第200页：E.coli DnaK

E.coli DnaK（Hsp70）

第201页：E.coli GroEL

E.coli GroEL（Hsp60）

第202页：第5节蛋白质的功能与进化一

第5节蛋白质的功能与进化一、蛋白质功能的多样性催化调节转运储存运动结构支架防御

第203页：二、肌红蛋白的结构与功能

1.肌红蛋白

第204页：分子大小：4.5×3.5×2.5nm氨基酸数量

分子大小

4.5×3.5×2.5nm氨基酸数量：153辅基：血红素8段α螺旋组成，最长的α螺旋有23个氨基酸，最短的有7个，分子中约80%的氨基酸在α螺旋区内。

第205页：哺乳动物肌肉中储氧气，球状分子，单结构域

哺乳动物肌肉中储氧气，球状分子，单结构域。辅基：血红素（卟啉铁），扁平状，结合在肌红蛋白的洞穴内。

第206页：原卟啉

原卟啉

第207页：血红素

血红素（卟啉铁）

第208页：铁离子的配位键

铁离子的配位键

第209页：F8 His

F8 His

第210页：O2和CO分别与肌红蛋白结合

O2和CO分别与肌红蛋白结合

第211页：

第212页：肌红蛋白和血红蛋白中的血红素

肌红蛋白和血红蛋白中的血红素

第213页：肌红蛋白的氧合曲线解离平衡

肌红蛋白的氧合曲线解离平衡

MbO2Mb+O2解离平衡常数：→

第214页：在给定氧压下肌红蛋白的饱和度：氧饱和度

在给定氧压下肌红蛋白的饱和度

氧饱和度

第215页：氧合曲线

氧合曲线

第216页：Y=1时

Y=1时，肌红蛋白的氧合位点全部被氧占据，达到饱和，K=0Y=0.5时，肌红蛋白一半的氧合位点与氧结合，PO2=K，解离常数K称为P50，即肌红蛋白一半被氧饱和时的氧气压。

第217页：血红蛋白主要形式HbA

血红蛋白主要形式HbA

α2β24个亚基聚集，每个亚基含有一个血红素。α、β亚基的三级结构与肌红蛋白相似，但一级结构不同，141个氨基酸中有20多个相同。

第218页：

第219页：

第220页：

第221页：

第222页：血红蛋白的氧合曲线

血红蛋白的氧合曲线

第223页：血红蛋白P50=26torr

血红蛋白P50=26torr：本节要点如下。

• 肺泡氧压Po2=100torr，血红蛋白Y=0.97肌肉毛细血管Po2=20torr，血红蛋白Y=0.25氧释放量△Y=0.97－0.25=0.72肌红蛋白P50=1torr
• 在20torr
• 时，肌红蛋Y≈1

第224页：别构效应

别构效应：本节要点如下。

• 别构效应一个配体与蛋白质上的一个结合部位结合后影响该蛋白质上其它结合部位的亲和力。
• 同促别构效应一个配体的结合影响同种配体的结合，正协同效应，S型氧合曲线。
• 异促别构效应一个配体的结合影响另一种配体的结合。

第225页：

第226页：血红蛋白的2种构象状态

松弛态R

松弛态R（relaxed state）：与氧亲和力高

紧张态T（tense state）

与氧亲和力低

第227页：2, 3-二磷酸甘油酸

2, 3-二磷酸甘油酸（BPG）引起的别构效应（异促别构效应）BPG与血红蛋白的2个β亚基形成盐键，稳定了血红蛋白脱氧态的构象（T态），加大了卸氧量，提高了输氧效率。

第228页：

第229页：波耳（Bohr）效应H+和CO2

波耳（Bohr）效应H+和CO2可改变血红蛋白的氧合曲线。波耳效应：增加H+和CO2浓度，氧合曲线向右移动，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放。

第230页：波耳（Bohr）效应

波耳（Bohr）效应

第231页：四、免疫球蛋白

免疫系统免疫

人和脊椎动物最重要的防御机制免疫应答：体液免疫、细胞免疫B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞抗原：进入异种机体后致敏淋巴细胞产生特异抗体的任何分子或病原体。

第232页：抗原决定簇

抗原决定簇（抗原表位epitope）

抗原分子表面特殊的化学基团。（一级结构、空间结构）作用A.激活免疫活性细胞产生抗体B.被抗体识别和结合抗原表位预测：http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl

第233页：抗体：在抗原刺激下

抗体

在抗原刺激下，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，能与对应的抗原特异结合。又称免疫球蛋白（Immunoglobulin）两个特点：A.高度特异性B.多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导对应的特异性抗体，人体内约有108种抗体。

第234页：多克隆抗体和单克隆抗体

多克隆抗体和单克隆抗体：本节要点如下。

• Polyclonal antibody多个不同的B淋巴细胞在应答一种抗原时产生的抗体，B细胞群的每个细胞产生一种结合抗体中特异表位的抗体。
• Monoclonal antibody由同一个B细胞的群体产生的抗体，是均一抗体，只能识别同一个抗原表位。

第235页：抗原与抗体结合

2.抗原与抗体结合

第236页：抗原与抗体结合A.

抗原与抗体结合A.抗原表位与抗体的结合部位构象互补B.有对应的化学基团相互结合（次级键）抗体2价，抗原多价。抗原－抗体比例适中时，形成网状复合物，产生免疫沉淀。

第237页：

第238页：

第239页：

第240页：

第241页：

第242页：

第243页：基于抗原抗体特异结合的蛋白质实验技术

基于抗原抗体特异结合的蛋白质实验技术：本节要点如下。

• 酶联免疫分析（ELISA）---检测enzyme-linked immunosorbent assay
• 蛋白质印迹（Western blotting）---检测
• 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）---分离纯化

第244页：ELISA

ELISA

第245页：ELISA

ELISA

第246页：Western Blotting

Western Blotting

第247页：Western Blot

Western Blot

第248页：Co-immunoprecipitation

Co-immunoprecipitation（Co-IP）

第249页：Co-immunoprecipitation

Co-immunoprecipitation（Co-IP）

第250页：五、血红蛋白与分子病分子病

五、血红蛋白与分子病分子病

基因突变→蛋白质中氨基酸改变→三维结构改变→功能部分或全部丧失镰刀状细胞贫血：血红蛋白发生了遗传突变，链第6位的Glu变成了Val。正常人血红蛋白：β链Glu6镰刀型贫血：β链Val6生理条件下电荷：Glu-亲水，Va10疏水

第251页：镰刀型红细胞贫血正常红细胞

镰刀型红细胞贫血正常红细胞

第252页：六、氨基酸序列与生物学功能

六、氨基酸序列与生物学功能同源蛋白质种属差异与生物进化（一级结构的种属差异）同源蛋白质：不同生物体内具有相同功能的蛋白质，由同一祖先进化而来。例如：血红蛋白－输送氧气细胞色素－组成电子传递链

第253页：同源蛋白特点

同源蛋白特点：本节要点如下。

• ①肽链长度相同或相近
• ②许多位置的氨基酸对所有种属都是相同的，称不变残基。高度保守，必需残基。
• ③其它位置的氨基酸对不同的种属差异很大，称可变残基。个别氨基酸的变化不影响蛋白质的结构与功能。

第254页：通过比较同源蛋白的氨基酸序列

通过比较同源蛋白的氨基酸序列，可以研究不同物种间的亲源关系和进化关系。同源蛋白的氨基酸序列差异越大，亲源关系越远。

第255页：细胞色素C的氨基酸差异

细胞色素C的氨基酸差异：下表列出相关数据。

第256页：

第257页：