04 Nucleic Acid.pptx

第1页：Chapter 4 Nucleic Acids

Chapter 4 Nucleic Acids

第2页：教学要求

教学要求：本节要点如下。

• 要求
• 1.了解核酸重要意义、分类、化学构
• 2.掌握DNA双螺旋结构模型
• 3.掌握三种RNA的结构与功能

第3页：教学要求（续）

教学要求（续）：本节要点如下。

• 4.掌握核酸紫外吸收、热变性、DNA复性与分子杂交、DNA的熔解温度、增色效应等概念
• 5.了解核酸的酶解作用，限制性内切酶的作用特点及应用
• 6.了解DNA一级结构的测定原理

第4页：1944 O. Avery，Pneumococcus

1944 O. Avery，Pneumococcus

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第11页：1952A.D.HersheyM.

1952A.D.HersheyM.Chase32P35S

第12页：4.1Components of Nucleic

4.1Components of Nucleic Acids

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第18页：一、BasePyrimidineandP

一、BasePyrimidineandPurine

第19页：PurineAdenine

2.PyrimidineCytosine、Uracil、Thymine

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第21页：PurineAdenine（续）

3.ModifiedBase100余种，多数是甲基化的产物，植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C

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第24页：二、核苷与脱氧核苷糖环C1与嘧啶碱N1

二、核苷与脱氧核苷糖环C1与嘧啶碱N1或与嘌呤碱N9连接，核酸中的核苷均为β-型核苷。

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第27页：三、核苷酸核苷中戊糖C

3、C5羟基被磷酸酯化

第28页：

第29页：构成DNA、RNA的核苷酸

构成DNA、RNA的核苷酸：本节要点如下。

• ①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用
• ②环核苷酸3’、5’-cAMP;3’、5’-cGMP激素的第二信使，cAMP调节糖代谢、脂代谢

第30页：核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpp、pppGpp

④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等的辅助因子在糖蛋白生物合成中，GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是活性的糖基供体

第31页：UDP-葡萄糖

UDP-葡萄糖

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第36页：4.2DNAPrimaryStructu

4.2DNAPrimaryStructure－SequenceSecondaryStructure－DoubleHelixTertiaryStructure－FoldingConformation

第37页：一、PrimaryStructuredAMP、dGMP

一、PrimaryStructuredAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。3’,5’-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构书写方向：5’→3’5’…ACTG…3’

第38页：DNA一级结构

DNA一级结构

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第40页：

第41页：二、DNA二级结构1953年Watson

二、DNA二级结构1953年Watson：本节要点如下。

• 和Crick
• 根据Chargaff
• 规律和DNA钠盐的X光衍射分析，提出DNA双螺旋结构模型。Chargaff
• 规律（1950年）a.DNA中，A=T，G=Cb.碱基组成具有物种特异性c.碱基组成没有组织和器官的特异性d.年龄、营养状况、环境等因素不影响碱基组成

第42页：1953年

1953年，Watson-Crick确定DNA双螺旋结构，1962年诺贝尔生理、医学奖。

第43页：Watson-Crick结构模型

1.Watson-Crick结构模型（B-DNA）

第44页：

第45页：★两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴缠成

★两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴缠成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’★嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋的外侧★磷酸与脱氧核糖通过3’5’-磷酸二酯键连接，构成DNA分子的骨架★大沟：宽、深小沟：窄、深

第46页：★双螺旋平均直径2.37nm

每圈螺旋含10.4个碱基碱基堆积距离

0.34nm

螺距

3.32nm★两条核苷酸链依靠碱基间形成的氢链结合在一起A=T,G=C

第47页：稳定双螺旋结构的因素

稳定双螺旋结构的因素：本节要点如下。

• ①碱基堆积力，形成疏水环境
• ②碱基配对的氢键，GC含量越多越稳定
• ③磷酸上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白形成离子键，削弱了磷酸基上的负电荷间的斥力
• ④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性小分子的攻击

第48页：三、DNA二级结构的多型性A-DNA

1.B-DNA典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双股螺旋

第49页：三、DNA二级结构（续）

三、DNA二级结构（续）：本节要点如下。

• 2.A-DNA右手双螺旋，外形粗短RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构
• 3.Z-DNA左手双螺旋DNA天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA

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第54页：三、DNA二级结构（续）

4.DNA三股螺旋（H-DNA）和四股螺旋DNA三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。TAT、C+GC两种碱基配对方式。

第55页：DNA三股螺旋

DNA三股螺旋

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第57页：DNA三股螺旋

DNA三股螺旋

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第62页：四、DNA二级结构的不均一性

1.反向重复序列（回文序列）较长的回文结构，可形成发夹结构和十字结构，与转录的终止有关。较短的回文结构通常是限制性核酸内切酶的识别位点。5-GGTACC-33-CCATGG-5

第63页：

第64页：反向重复序列

反向重复序列

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第66页：反向重复序列

反向重复序列

第67页：

第68页：富含AT的序列很多有重要调节功能

2.富含AT的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区富含AT。

第69页：

第70页：五、环状DNA部分病毒DNA部分噬菌体D

五、环状DNA部分病毒DNA部分噬菌体DNA部分细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体和叶绿体DNA

第71页：环状DNA的不同构象松驰环解链环和负超螺

1.环状DNA的不同构象松驰环解链环和负超螺旋

第72页：松弛环形DNA，线形DNA直接环化

松弛环形DNA，线形DNA直接环化：本节要点如下。

• （2）解链环形DNA，线形DNA拧松后再环化
• （3）正超螺旋与负超螺旋DNA正超螺旋：线形DNA双链一端固定，另一端向缠紧的方向旋转几圈，再将两端连接起来，DNA双链间会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变。

第73页：负超螺旋：线形DNA双链一端固定

负超螺旋

线形DNA双链一端固定，另一端向松弛的方向旋转几圈，再将两端连接起来，DNA双链间会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变。

第74页：环形DNA的拓扑学特性以260bp组成

2.环形DNA的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25①连环数（L）：DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23

第75页：缠绕数（T）：DNA分子中Watson-

③超螺旋数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W=-2L=T+W

第76页：比连环差（λ）表示DNA的超螺旋程度

④比连环差（λ）表示DNA的超螺旋程度，λ=（L-L0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的λ一般为-0.03－-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，容易解链，有利于DNA的复制、重组和转录。

第77页：

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第79页：拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值

拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值：本节要点如下。

• ①拓扑异构酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1。
• ②拓扑异构酶II（拧松）能使正超螺旋转变成松驰DNA，每次催化使L减少2。

第80页：六、染色体结构

1.大肠杆菌染色体双链环状DNA，4.2×106bp，约3000个基因。大肠杆菌DNA结合蛋白：每个细胞H两个28KD的相同亚基30000个二聚HU两个各9KD的不同亚基40000个二体聚HLP117KD的亚基20000个单体P3KD的亚基未知

第81页：大肠杆菌染色体

大肠杆菌染色体

第82页：DNA与结合蛋白压缩成手脚架结构

DNA与结合蛋白压缩成手脚架结构，中心是DNA结合蛋白。DNA上有多个位点与这些蛋白结合，形成约100个小区。每个小区的DNA都是负超螺旋，两个端点被蛋白质固定。用极微量的DNA酶I水解，能使少数小区的DNA变为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。

第83页：真核染色体组蛋白富含碱性氨基酸，分为H

真核染色体组蛋白富含碱性氨基酸，分为H：本节要点如下。

• 1、H2A、H2B、H
• 3、H4五种，都是单链蛋白质，分子量11000-21000。H2A、H2B、H
• 3、H4各两分子对称聚集成八聚体。146bp长的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp，其上结合H1。

第84页：

第85页：2H2A、2H2B、2H3

2H2A、2H2B、2H3、2H4八聚体146bp DNA核小体串联染色质折叠染色体

第86页：DNA（直径2nm）盘绕组蛋白

DNA（直径2nm）盘绕组蛋白，结合H1，压缩比1/7核小体螺旋化，压缩比1/6螺线管再螺旋化，压缩比1/40超螺线管折叠，压缩比1/5染色单体总压缩比：1/8400~1/10000

第87页：4.3 RNA的结构一

4.3 RNA的结构一、RNA的一级结构AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体，组成RNA的戊糖是核糖。RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子是单链线形分子，部分区域有A-型双螺旋结构。

第88页：

第89页：二、tRNA的结构70-90b

二、tRNA的结构70-90b，25KD，沉降系数4S。有较多稀有碱基。3’端CpCpA-OH，接受活化的氨基酸。5’末端大多为pG…或pC…二级结构是三叶草形

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第93页：三、mRNA的结构

1.真核mRNA（1）3’端有20-250的polyApolyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA上polyA较长；衰老的polyA较短。功能：mRNA进入胞质的必需形式提高mRNA在胞质中的稳定性

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第97页：5’-帽子结构：3’-mG-5’ppp5

5’-帽子结构

3’-mG-5’ppp5’-Nm-3’-P5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。功能：抵抗5’核酸外切酶降解。为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。

第98页：5’-帽子结构

5’-帽子结构

第99页：原核mRNA没有5’帽子和3’polyA

2.原核mRNA没有5’帽子和3’polyA。SD序列：5’端先导区中有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处。SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。

第100页：四、rRNA的结构

四、rRNA的结构与核糖体结合蛋白一起构成核糖体。原核rRNA：5S、16S、23S真核rRNA：5S、5.8S、18S、28S

第101页：大肠杆菌5S rRNA结构

大肠杆菌5S rRNA结构

第102页：16 S rRNA

16 S rRNA

第103页：4.4核酸的性质一、物理性质

4.4核酸的性质一、物理性质：本节要点如下。

• 1.性状RNA是白色粉末或结晶，DNA是疏松的纤维状固体。
• 2.粘性核酸水溶液的粘度很大，DNA溶液的粘度大于RNA，核酸变性后，粘度下降。

第104页：4.4核酸的性质一、物理性质（续）

4.4核酸的性质一、物理性质（续）：本节要点如下。

• 3.溶解性RNA和DNA微溶于水，不溶于乙醇、氯仿，它们的钠盐易溶于水。DNA核蛋白在1.4 mol/L NaCl
• 溶液中的溶解度最高，在0.14 mol/L NaCl
• 中溶解度最低。RNA核蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小。

第105页：二、核酸的水解

二、核酸的水解

第106页：酸碱水解室温条件下

1.酸碱水解室温条件下，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，而DNA不被水解。RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。DNA稳定，保留和传递遗传信息。RNA是信使，完成翻译任务后被降解。

第107页：

第108页：酸碱水解室温条件下（续）

2.酶水解RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外切酶核酸内切酶限制性核酸内切酶

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第112页：

第113页：

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第115页：三、解离性质核酸的磷酸基具有酸性

三、解离性质核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约4～5，RNA的pI约2.0～2.5，在pH 7～8电泳时向正极移动。

第116页：四、光吸收性λmax=260nm

鉴定纯度DNA

A260/A280＝1.8（1.65-1.85）若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解RNA：A260/A280＝2.0若有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低

第117页：

第118页：四、光吸收性λmax=260nm（续）

含量计算1.0ABS相当于

50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸

增色效应与减色效应增色效应

DNA变性时摩尔吸光系数增大减色效应：DNA复性时摩尔吸光系数减小。

第119页：

第120页：五、沉降特性（DNA）不同构象的核酸

五、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可以将它们区分开来。这一方法常用于质粒DNA的分离纯化。

第121页：DNA的相对沉降常数

DNA的相对沉降常数：下表列出相关数据。

第122页：CsCl密度梯度离心

CsCl密度梯度离心

第123页：六、变性与复性

1.变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链。变性发生在一个很窄的温度范围内。因素：热、酸碱（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）现象：吸光度升高，粘度降低，密度升高二级结构改变，部分失活

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第127页：熔解温度（Tm）DNA双螺旋结构

（1）熔解温度（Tm）DNA双螺旋结构解链50%时的温度。浓度50ug/mL时，双链DNA的A260=1.00完全变性时，A260=1.37当A260增加到最大增加值一半时（1.185），对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在70-85℃之间。

第128页：

第129页：影响DNATm值的因素A.DNA均一性

（2）影响DNATm值的因素A.DNA均一性：均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。B.G-C含量与Tm值成正比G-C%=（Tm-69.3）×2.44C.离子强度：离子强度越高，Tm越高。

第130页：

第131页：离子强度与Tm值

离子强度与Tm值

第132页：复性变性的DNA在适当条件下

复性变性的DNA在适当条件下：本节要点如下。

• 衡量。Co
• 是DNA的起始浓度mol·L-1t
• 是时间（秒）

第133页：DNA复性曲线

DNA复性曲线

第134页：★1个核苷酸对

★1个核苷酸对（AU），若浓度为Co=1.0mmol/L，50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒★E.coli4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，115天复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，约5758天★复性机制：10-20bp成核，拉链。

第135页：4.5核酸研究技术一

4.5核酸研究技术一、核酸的分离纯化保持天然状态条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌抑制核酸酶

第136页：DNA提取纯化真核DNA核蛋白在1.4

DNA提取纯化真核DNA核蛋白在1.4：本节要点如下。

• 中溶解度高，在0.14mol/LNaCl
• 中溶解度低。利用此性质可将DNA核蛋白与RNA核蛋白分开。DNA核蛋白可用苯酚和氯仿-异戊醇去除蛋白质。

第137页：DNA提取纯化（续）

2.RNA提取纯化（mRNA）用0.14mol/LNaCl使DNA核蛋白沉淀，RNA核蛋白在上清液中。去蛋白：盐酸胍、苯酚等抑制RNA酶

第138页：二、核酸的凝胶电泳1.琼脂糖电泳

二、核酸的凝胶电泳1.琼脂糖电泳：本节要点如下。

• ①核酸分子大小迁移率与分子量的对数成反比
• ②凝胶浓度
• ③DNA构象超螺旋最快，线形，环形
• ④电压5V/cm2.PAGE电泳

第139页：DNA琼脂糖电泳-+

DNA琼脂糖电泳-+

第140页：EB染色

EB染色（溴化乙锭）

第141页：三、限制性核酸内切酶

1.限制修饰作用

第142页：三、限制性核酸内切酶（续）

2.II型核酸内切酶限制、修饰活性分开，单体蛋白，辅助因子Mg2+，位点序列反向重复。II型酶的切割频率识别位点：444=256646=4096848=65536

第143页：限制酶的命名：E.coRI第一位属名

限制酶的命名

E.coRI第一位属名，大写E第二、三位种名的头两个字母，小写co第四位菌株R第五位从该细菌中分离出来的这一类酶的编号

第144页：EcoRI酶切位点

EcoRI酶切位点

第145页：同裂酶：来源不同的限制性核酸内切酶

同裂酶

来源不同的限制性核酸内切酶，识别位点和切割位点相同。例：BamHIG↓GATCCBstIG↓GATCC同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，切割后产生相同的粘性末端。例:BclIT↓GATCA，BglIIA↓GATCT

第146页：四、分子杂交

四、分子杂交

第147页：

第148页：SouthernBlotting1975

1.SouthernBlotting1975年由英国人Southern创建，用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位可用DNA或RNA探针可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析

第149页：

第150页：DNA样品→酶切→电泳→变性→转膜

DNA样品→酶切→电泳→变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80℃，4-6hs）杂交（高盐浓度，68℃，几小时）

第151页：NorthernBlotting1979

2.NorthernBlotting1979年，J.C.Alwine创建研究对象是mRNA，探针一般是DNA总RNA或mRNA在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）

第152页：

第153页：五、DNA序列分析

1.化学裂解法用特异性的化学裂解法，制备出具有同一放射性标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，将此片段群在PAGE上分离。

第154页：硫酸二甲酯特异切割：G甲酸特异切割

条件下切割

C肼在无NaCl

条件下切割

T和C

第155页：32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯

32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯（G）：*ACTTC甲酸（G、A）：*P*ACTTC*ACTTCG*ACTTCGAC*ACTTCGACA

第156页：32P*ACTTCGACAA肼

32P*ACTTCGACAA肼（NaCl）（C）：*A*ACTT*ACTTCGA肼（无NaCl）（C、T）：*A*AC*ACT*ACTT*ACTTCGA

第157页：化学裂解法测定DNA序列

化学裂解法测定DNA序列

第158页：化学法测定DNA序列

化学法测定DNA序列

第159页：双脱氧终止法

2.双脱氧终止法（英国Sanger）1955年测定牛胰岛素结构，获诺贝尔化学奖1980年设计出DNA测序法，获诺贝尔化学奖策略：合成与待测DNA序列互补的DNA片段群

第160页：

第161页：

第162页：

第163页：

第164页：

第165页：

第166页：

第167页：六、DNA合成

1.化学合成（3’→5’端）固相合成，亚磷酸三酯法。5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，二氯乙酸脱保护。3’-OH用氨基磷酸化合物活化，碱基上氨基用苯甲酸保护。保护5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2

第168页：

第169页：

第170页：

第171页：六、DNA合成（续）

六、DNA合成（续）：本节要点如下。

• 2.酶法合成（PolymeraseChainReaction，PCR）
• ①模板DNA（单链）
• ②引物
• ③DNA聚合酶
• ④dATP、dGTP、dCTP、dTTP
• 一定浓度的Mg2+合成方向：5’→3’端化学合成：方向3’→5’，不需酶和DNA模板生物合成：方向5’→3’，需模板、引物和酶