第1页：蛋白质和氨基酸的测定
蛋白质和氨基酸的测定1概述2凯氏定氮法3氨基酸总量的测定4氨基酸的分离与测定
第2页：蛋白质测定概述
1概述
- 蛋白质的生理功用及在食品中的作用
- 食品中的蛋白质含量
- 蛋白质系数
- 蛋白质水解
- 蛋白质测定方法
第3页：蛋白质的生理功用
1概述①蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。
②人体的酸碱平衡、水平衡的维持；
③遗传信息的传递；
④物质的代谢及运转都与蛋白质有关。
⑤人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质⑥食品的重要营养指标。
第4页：食品中的蛋白质含量
- 食品中的蛋白质含量在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为2
- 0%左右，猪肉中为
- 5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为
- 5%
第5页：蛋白质的分子组成
- 蛋白质系数蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万~数百万，分子的长轴则长数nm~100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、
第6页：蛋白质系数
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于
- 25份蛋白质，此数值（
- 25）称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，
第7页：必需氨基酸
- 蛋白质水解在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极
第8页：蛋白质测定方法的分类
- 蛋白质测定方法测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。
第9页：凯氏定氮法
蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法：是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。
方法简便快速，
第10页：凯氏定氮法的原理
蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。
不同食品的蛋白质系数有所不同。
凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。
2凯氏定氮法
第11页：凯氏定氮法的分类
- 凯氏定氮法
- 常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。
目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。
在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。
常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了
第12页：常量凯氏定氮法的原理
主要学习(1)原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
第13页：消化反应方程式
- 消化反应方程式如下
- 使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
①样品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O浓硫酸具有脱水性，浓硫酸又具有氧化性H
第14页：加碱蒸馏与硼酸吸收
在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝
- 8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，
第15页：凯氏定氮法的试剂
此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定①硫酸铜；
②硫酸钾；③硫酸；
- ④40g∕L硼酸溶液
- ⑤混合指示剂：1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。
或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；
⑥400g∕L氢氧化钠；⑦
第16页：操作步骤总览
样品消化蒸馏、吸收滴定(5) 操作步骤
第17页：样品消化与蒸馏装置
第18页：样品的称取与消化
- 测定方法：准确称取均匀的固体样品
- 5～3g,或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入
- 5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°
第19页：蒸馏与吸收操作
②蒸馏、吸收
第20页：蒸馏装置的安装
，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。
在按图装好蒸馏装置凯氏烧瓶内加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。
不要摇动，将定氮球连接好。
用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继
第21页：硼酸吸收液的滴定
③滴定将接受瓶内的硼酸液用
- 1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。
第22页：蛋白质质量分数的计算
式中W—蛋白质的质量分数，%；
c—盐酸标准液的浓度，mol/L；
V1—空白滴定消耗标准液量，mL；
V2—试剂滴定消耗标准液量，mL；
m—样品质量，g；
- 014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数。
- 结果计算
第23页：微量凯氏定氮法
- 2微量凯氏定氮法
- 微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。
- 原理
第24页：微量凯氏定氮的仪器
①100ml凯氏烧瓶。
②微量凯氏定氮器。
第25页：微量凯氏定氮的试剂
①20g/L硼酸溶液。
②400g/L氢氧化钠。
③1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。④
- 01000mol/L盐酸标准溶液⑤其他试剂同常量法。
- 试剂
第26页：微量法的样品消化
：样品消化步骤同常量法。
将消化完全的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。
第27页：微量定氮蒸馏装置
②蒸馏按图安装好微量定氮蒸馏装置。
于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加
第28页：反应室的进样操作
，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。
再从进样口加入
第29页：微量法的滴定与计算
：取下接受瓶，以
- 01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。③滴定式中W—蛋白质的质量分数，%；V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL；C—盐酸标准液的浓度，mol/L；
- 014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数；m—样品质量，g。
- 结果计算
第30页：样品的分解条件
- 3样品的分解条件
- K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸点：CuSO4 C＋2CuSO4 →Cu2SO4 ＋SO2↑＋CO2↑Cu2SO4＋2H2SO4 →2CuSO4＋2H2O ＋SO2↑氧化汞和汞良好的催化剂，但剧毒；硒粉
- 氧化剂过氧化氢
- 催化剂
第31页：硫酸钾提高沸点的作用
硫酸钾加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，
第32页：硫酸铜的催化作用
硫酸铜CuSO4①催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。
②可以指示消化终点的到达③下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。作用
第33页：消化操作的注意事项
- 所用试剂应用配制。
- 消化过程应注意凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。
- 若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。
- 若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2~3ml后再加热。
- 4
第34页：催化剂与碱化判断
- 起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。
- 若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。
- 消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。，但当含有特别难以氨化的氮化
第35页：蒸馏结束的操作顺序
- 蒸馏过程应注意接头处无现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。
- 不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，
第36页：蛋白质的水解与氨基酸
蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。
氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人
第37页：氨基酸态氮的测定方法
氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算
第38页：双指示剂甲醛滴定法的原理
- 1双指示剂甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式（有三种不同的推论）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO
第39页：甲醛滴定法的特点与应用
- 方法特点及应用此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。
第40页：中性甲醛与指示剂
- 试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。②
- 1%百里酚酞乙醇溶液③
- 1%中性红50%乙醇溶液④
- 1%mol/L氢氧化钠标准溶液(4)操作方法移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红置试剂，用
第41页：氨基酸态氮的计算
式中c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;
V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;
V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;
m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g
- 014——氮的毫摩尔质量，g/m mol(5) 结果计算氨基酸态氮（%）
第42页：电位滴定法的原理
- 2电位滴定法
- (1)原理
- 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。
- (2)仪器
第43页：电位滴定的仪器
磁力搅拌器
第44页：滴定管与缓冲液试剂
- 酸式滴定管
- 25mL
- 胖肚吸管
- 10mL
- 酚酞乙醇指示液
- 1%
- 硼砂（标准物质）缓冲液
- PH
- 22称取
- 8克
- Na2B4O7溶解后，定容至1000mL
- 甲醛
- 36%-----38%
第45页：氢氧化钠标准溶液的配制
- 配制
- 称取氢氧化钠120g于200mL烧杯中，加蒸馏水100mL搅拌使其溶解，冷却后，摇匀，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，放置数日。
澄清后，吸取上层清液
- 标定
- 称取在105~110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾
- 2000g于250mL锥形瓶中，加蒸馏水50mL使其溶解，加酚酞指示液2
第46页：氢氧化钠溶液的标定
- 式中
- C-----氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L：
- G------邻苯二甲酸氢钾的重量，g；
- V-----氢氧化钠溶液用量，mL
- V0----空白试验氢氧化钠溶液用量，mL；
- 20
- 2—邻苯二甲酸氢钾的分子量。•按下式计算NaOH标准溶液的量浓度C=G(V-V0) ⅹ10-3ⅹ20
- 2
第47页：电位滴定的试验步骤
- (4)试验步骤
- ①吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取2
- 0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用
- 05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH
- 2（记下消耗
- 05mol/L
第48页：电位滴定的数据记录
- 结果计算
- ①数据记录加甲醛前耗NaOH量/mL加甲醛后耗NaOH量/mLNaOH标准液浓度/mol.L-1样品滴定123平均空白滴定123平均
第49页：氨基酸态氮质量浓度的计算
- 式中ρ--------------氨基酸态氮质量浓度，g/100mL;
- c--------------氢氧化钠浓度，mol/L；
- V1------------加入甲醛后耗NaOH的量，ml；
- V2------------空白试验加甲醛后耗NaOH量，ml；
- V3------------测定用样品稀释液的量，ml；
- M氮----------氮的摩尔质量，1
- 01g/mol；
- 5-------------样品量，ml.②计算氮
第50页：允许误差与方法说明
- 允许误差
- 03g/100ml
- 说明
- ①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定
- ②对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。
第51页：平行实验与结果处理
- 平行实验与结果处理
- 平行实验是指在相同条件下同时作两份测定.
- 如果两份之间偏差不超过允许范围,说明该样品的测定在精密度方面是可靠的,可将两份测定结果取平均值;如果偏差超过允许范围,,则应重做.在食品检验中,如果偏差没有特殊规定,偏差的允许范围一般≦20%,其计算方法如下:
- 偏差(%)=A-B/A+B×100
- 2
- 式中
- A、B为两次平行测定的结果。
