07 第七章 蛋白质与氨基酸的测定.PPT

第1页：第七章 蛋白质与氨基酸的测定 封面

食品分析　第七章　蛋白质与氨基酸的测定

目录

1. 第一节　概述
2. 第二节　各种食品中蛋白质含量及测定意义
3. 第三节　蛋白质换算系数
4. 第四节　蛋白质的测定方法

第2页：概述：蛋白质与食品营养

第一节 概述

蛋白质是食品的重要组成之一，也是重要的营养物质，一个食品的营养高低主要看蛋白质的高低。蛋白质除了保证食品的营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。

第3页：

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第5页：蛋白质的组成与分类

一、蛋白质组成与分类　1、组成

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，是由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物。它主要含的元素是 C、H、O、N、S、P，另外还有一些微量元素 Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，其组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质……

注：源文件该页末句未完整提取。

第6页：蛋白质的平均含氮量与换算系数

一般来说，蛋白质的平均含氮量为 16%（100/16），故用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总氮% 乘上蛋白质换算系数 K=6.25 即为该物质的蛋白质含量。

注意：当测定样品的含氮系数与 16% 相差较大时，采用 6.25 将会引起显著的偏差。

注：源文件「平均含氮量为 100/160」疑为「100/16（16%）」之误，已按通行值修正。

第7页：氨基酸的组成

2. 氨基酸的组成

蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已达 175 种以上，但构成蛋白质的主要是其中的 20 种。氨基酸是由脂肪酸碳链上的氢原子被氨基（—NH₂）置换而得到的。

第8页：蛋白质变性

二、蛋白质变性

蛋白质受热或其它处理时，物理和化学性质会发生变化，这个过程称为变性作用。变性后溶解度降低、发生凝结、形成不可逆凝胶，—SH 暴露在外面。引起蛋白质变性的因素主要是热、酸和碱、化学试剂、重金属盐等。

第9页：各种食品中蛋白质的含量

第二节 各种食品中蛋白质的含量及测定意义　一、含量

由于食品种类很多，蛋白质含量分布是不均匀的：一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，动物组织以肌肉、内脏含量较多；植物以种子含量高，豆类含蛋白质最高，如黄豆蛋白质含量在 40%。

第10页：蛋白质测定的意义

二、测定意义

1. 蛋白质是组成人体的重要成分之一，人体的一切细胞都由蛋白质组成。
2. 蛋白质维持体内酸碱平衡。
3. 蛋白质是食品的重要组成部分之一，也是重要的营养物质。
4. 蛋白质是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。

第11页：氮—蛋白质换算系数

第三节 关于氮—蛋白质换算系数

对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历来采用 6.25，这个数值是由蛋白质平均含氮量导出的。但食品中含氮比例因种类不同差别很大，测定蛋白质时不同食品应采用不同换算系数，一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查；若手册上查不到则可用 6.25，写报告时要注明采用的换算系数。

第12页：常用食品的蛋白质换算系数表

第13页：蛋白质测定方法的分类

第四节 蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法分为两大类：

• 一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽链和折射率测定蛋白质含量；
• 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。

注：食品中碳水化合物、脂肪和维生素等干扰成分很多，源文件该页末句未完整提取。

第14页：凯氏定氮法的由来与改进

一、凯氏定氮法

这种方法由 Kjeldahl 于 1883 年发明，当时只使用 H₂SO₄ 分解试样定量谷物中的蛋白质，而不能阐明其反应历程，故需较长时间。后来由 Gunning 改进，在消化时加入 K₂SO₄ 使沸点上升，从而加快分解速度……

注：源文件该页末句未完整提取。

第15页：粗蛋白质的含义

检验食品中蛋白质时往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数得到蛋白质含量。实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。

第16页：凯氏定氮法试验装置图

凯氏定氮法试验仪器图

第17页：凯氏常量定氮法：消化

1、凯氏常量定氮法　（1）消化

不论常量、半微量以及微量定氮法，原理都是一样的，第一个步骤是消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，使有机物中的 C、H 氧化为 CO₂ 和 H₂O 蒸汽逸出，而蛋白质分解释出的氮则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。

第18页：硫酸钾提高沸点的作用

在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度、加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度：一般纯硫酸加热沸点 330℃，添加硫酸钾后温度可达 400℃，加速了整个反应过程。此外也可加入硫酸钠、氢化钾盐类来提高沸点。

第19页：催化剂与氧化剂的使用

为了加速反应过程，还加入硫酸铜、氧化汞或硒粉作为催化剂，以及加入少量过氧化氢、次氯酸钾作为氧化剂，但为防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后出现硫酸铜的蓝绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。

第20页：蒸馏：碱化释放氨

（2）蒸馏

样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨。操作中一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。

第21页：吸收与滴定

（3）吸收与滴定

蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液吸收，再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的酸，从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后再用标准盐酸直接滴定：硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。

第22页：凯氏定氮法操作步骤

操作步骤

准确称取样品 0.50-2.00g → 于 500ml 凯氏瓶中 → 加 10g 无水 K₂SO₄ → 加 0.5g CuSO₄ → 加 20ml H₂SO₄ → 在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后加大火力 → 消化至透明无黑粒后摇动瓶子使瓶壁炭粒溶于硫酸中 → 继续消化 30 分钟 → 至样液呈绿色状态停止消化，冷却 → 加 200ml 水……

注：源文件该页末句未完整提取。

第23页：总氮量与蛋白质含量计算

计算

总氮量% = N（V2－V1）×0.014 / W × 100　；　蛋白质% = 总氮% × K

注：本页小麦粉系数 5.79 与前页小麦 5.83 略有出入，均按原文保留，建议对照原图核校。

第24页：浓硫酸在消化中的作用

各种试剂的作用　（1）浓 H₂SO₄

1. 脱水使有机物炭化，炭化生成碳，碳将 H₂SO₄ 还原为 SO₂，本身变为 CO₂；
2. 氧化作用；
3. 蛋白质与浓 H₂SO₄ 生成 NH₃↑、CO₂、SO₂、H₂O↑；
4. NH₃ 与 H₂SO₄ 生成硫酸铵。

第25页：硫酸铜与硫酸钾等试剂的作用

2. CuSO₄ 的作用（催化剂）：CuSO₄ 为红色沉淀，当碳完全消化后反应停止，红色消失变为蓝色，即为消化完全，蓝色为 CuSO₄ 的颜色。
3. K₂SO₄ 的作用（提高沸点）：沸点由 330℃ 提高到 400℃，加速了反应过程。
4. 硒粉、过氧化氢、氧化汞都作催化剂，但为防止污染通常采用硫酸铜。
5. 50% NaOH 的作用……

注：源文件该页末项未完整提取。

第26页：凯氏烧瓶与取样量

影响氨化完全和速度的因素　（1）凯氏烧瓶和取样量

如果称 1g 以上的样品，凯氏烧瓶最小需 500ml，800~1000ml 更好，这样的凯氏烧瓶对于缩短氨化时间、加热的均匀性和完全氨化效果最好。

第27页：分解剂的添加量

（2）分解剂　① H₂SO₄ 和 K₂SO₄ 的添加量

有机物分解需要 H₂SO₄，其量应根据有机物种类而定；试样含脂类高则加 H₂SO₄ 多。为提高分解温度要大量添加 K₂SO₄，但不能太多也不能太少，太少则氨化不充分。

注：源文件该页末句（K₂SO₄ 与 H₂SO₄ 添加比例）未完整提取，建议对照原图补充。

第28页：催化剂种类与消化时间对比

② 催化剂

用作催化剂的有 Hg、HgO、Se、硒化合物、CuSO₄、TiO₂。

注：给出测定结果时要注明催化剂的类型。

第29页：热源强度的影响

（3）热源的强度

消化时热源强度同迅速消化和完全氨化关系很大：即便 K₂SO₄ 加得多，如果热源弱也是没有意义的；热源过强会导致 H₂SO₄ 损失，使氨回收率低。另外凯氏瓶容量大小、颈部粗细和长短等也与热源强度有关。

第30页：氨的蒸馏吸收与碱液用量

（4）氨的蒸馏、吸收及滴定

蒸馏有两种：1 直接蒸馏（装置简便、准确性好）；2 水蒸汽蒸馏。蒸馏加 NaOH 为 50%，加量为 H₂SO₄ 量的 4 倍：硫酸量为 12ml，则 NaOH 为 12×4=48ml，一般高于这个理论值，即加到 50~55ml。如果 NaOH 量加得不够就生成 H₂S，H₂S 是强酸，使颜色变红。

第31页：吸收液的选择与硼酸吸收

吸收液

1. 标准 H₂SO₄：用标准碱返滴定，甲基红指示剂。
2. 硼酸：用 HCl 进行滴定，混合指示剂。

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H₂SO₄，可省略反滴定。H₂SO₄ 是强酸，要求较严；而硼酸是弱酸，滴定时不影响指示剂变色范围。另外硼酸吸收液浓度在 3% 以上可将氨完全吸收，为保险起见一般用 4%。

第32页：实验注意事项（一）

实验注意事项

1. 样品应是均匀的，固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
2. 样品放入凯氏烧瓶时不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全使结果偏低。
3. 消化时如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后加入 30% 过氧化氢催化剂 2~3ml 促使氧化。

第33页：实验注意事项（二）

4. 整个消化过程中不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下使氮损失。
5. 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，会形成硫酸氢钾而不与氨作用；因此当硫酸被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
6. ……

注：源文件该页 f 项未完整提取。

第34页：实验注意事项（三）

7. 氨是否完全蒸馏出来，用 pH 试纸检查馏出液是否为碱性。
8. 向蒸馏瓶中加入浓碱时往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应生成氢氧化铜，加热后又分解生成氧化铜沉淀，有时 Cu 离子与氨作用生成深蓝色络合物。
9. 消化液变绿色后继续消化 30 分钟即可。

第35页：微量与半微量定氮法

2、凯氏微量定氮仪法　3、凯氏半微量定氮仪法

二者原理相同，操作方法大同小异：半微量法消化后定容 100ml，然后吸 25ml 蒸馏吸收液吸收。

总氮% = N（V2－V1）×0.014 /（W×10/100）×100

第36页：凯氏自动定氮法

4、凯氏自动定氮法

原理与上面一样。仪器采用凯氏自动定氮仪，装置内具有自动加碱蒸馏装置、自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置；消化装置由优质玻璃制成的凯氏消化瓶以及红外线装置的消化炉组成。

第37页：氨基酸总量测定的意义

氨基酸总量测定

蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸。水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性、化学结构以及被吸收消化的程度上很不相同，其差别与水解程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也可以评价食品的营养价值。

第38页：氨基酸态氮的表示

氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出 17 种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用）。对于食品来说有时多种氨基酸同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示；当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸……

注：源文件该页末句未完整提取。

第39页：必需氨基酸的分离与鉴定

食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定蛋白质含量、氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离、鉴定，尤其对 8 种人体必需氨基酸进行定量定性分析。

第40页：单指示剂甲醛滴定法原理

单指示剂甲醛滴定法　1、原理

氨基酸具有酸、碱两重性质：含 —COOH 基显示酸性，又含 —NH₂ 显示碱性，由于二者相互作用使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH₂ 与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定 —COOH 基……

注：源文件该页末句未完整提取。

第41页：单指示剂甲醛滴定法试剂

2、试剂

1. 40% 中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用 1N NaOH 溶液中和（淡蓝色）。
2. 0.1% 百里酚酞乙醇溶液。
3. 0.100N NaOH 标准溶液。

第42页：单指示剂甲醛滴定法操作与计算

3、操作步骤

称取约含 20mg 氨基酸的样品于烧杯中（如为固体样加水 50ml）→ 加两滴指示剂 → 用 0.1N NaOH 溶液滴定到淡蓝色 → 加中性甲醛 20ml → 摇匀 → 静置 1 分钟 → 此时蓝色应消失 → 再用 0.1N NaOH 溶液滴定至淡蓝色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。

氨基酸态氮（%）=（N×V×0.014×100）/ W

第43页：双指示剂甲醛滴定法原理与试剂

双指示剂甲醛滴定法　1．原理

氨基酸具有酸性的 —COOH 基和碱性的 —NH₂ 基，二者相互作用使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH₂ 基与甲醛结合，从而使其碱性消失，这样就可以用强碱标准溶液来滴定 —COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。

2．试剂：中性红指示剂、百里酚酞指示剂、中性甲醛、0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液。

第44页：双指示剂甲醛滴定法操作方法

3．操作方法

移取含氨基酸约 20-30mg 的样品溶液 2 份，分别置于 250mL 锥形瓶中，各加 50mL 蒸馏水：其中 1 份加入 3 滴中性红指示剂，用 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另 1 份加入 3 滴百里酚酞指示剂及中性甲醛 20mL，摇匀，静置 1 分钟，用 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定……

注：源文件该页末句未完整提取。

第45页：双指示剂甲醛滴定法计算

4．计算

氨基酸态氮（%）= C（V1－V2）×0.014 / m × 100

• C — 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L
• V2 — 用中性红指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml
• V1 — 用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml
• m — 测定用样品溶液相当于样品的质量，g
• 0.014 — 氮的摩尔质量，g/mmol

注：源文件未给出算式，已按式中符号含义补写，建议对照原图核校。

第46页：双指示剂法说明与注意事项

5．说明及注意事项

1. 此法适用于测定食品中的游离氨基酸。
2. 若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。

第47页：第七章思考题

思考题

1. 试述蛋白质测定中样品消化过程必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
2. 样品经消化进行蒸馏前为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化说明什么问题？须采用什么措施？
3. 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？
4. 试述氨基酸态氮的测定原理。
5. ……

注：源文件该页第 5 题未完整提取。