09 第九章 维生素的测定.PPT

第1页：第九章 维生素的测定 封面

食品分析　第九章　维生素的测定

目录

1. 第一节　概述
2. 第二节　脂溶性维生素的测定
3. 第三节　水溶性维生素的测定

第2页：维生素的生理作用

第一节 概述

维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足，或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明，仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。

第3页：测定维生素的意义

因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用。测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。

第4页：维生素的分类

维生素的种类

维生素的种类繁多，而且这些有机物的结构也很复杂，有的属于胺类（如 B₁），有的属于醛类（如 B₆），有的属于醇类（如 A），有一些属于酚或醌类化合物等。目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：一类是能溶在脂肪中的，叫脂溶性维生素（如 A、D、E…）。

第5页：常见维生素的生理功能

在这二类中与我们最密切，而且了解最多的有：

• 维生素 A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病；
• 维生素 B₁：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育；
• 维生素 B₂：对人体功能防口角炎、皮肤炎。

第6页：维生素A的来源与测定方法

第二节 脂溶性维生素的测定　一、维生素 A

目前维生素 A 都是合成的，来源：①从动物肝脏中得到；②从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是 β-胡萝卜素）。

维生素 A 的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

第7页：两种维生素A测定法的选用

对于三氯化锑比色法，适用于样品中含 V_A 高的样品，方法简便、快速、结果准确；但是对维生素 A 含量低的样品，如每克样品中含 5～10μg 维生素 A 时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。对于紫外分光光度法，不必加显色剂显色，可直接测定维生素 A 的含量，对样品中含 V_A 低的样品也能测定。

第8页：维生素A的性质

1、维生素 A 的性质

1. 因有许多不饱和链，故见光易分解；
2. 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间短，因为时间长、见光时间长、见光分解，故测出的比出厂的含量要少；
3. 对碱稳定。

第9页：样品的提取与皂化

2、测定步骤

1. 样品用有机溶剂萃取脂类：样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。
2. 脂类的皂化：脂类有维生素和脂肪这两部分，通过皂化（50% KOH、无水乙醇）使脂肪与维生素分开。

第10页：皂化条件与提取

皂化条件

• C₂H₅OH∶脂类 = 8∶1；
• KOH 量 = 脂量 × 皂化价（mg）× 2.5；
• 皂化温度与时间：70℃、30 分钟。

在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。

提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取，可得到不皂化物。

第11页：柱层析分离干扰物质

⑷柱层析分离干扰物质

采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把 β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素 A 与 β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素 A 而不含 β-胡萝卜素时，这时可直接定容。

第12页：三氯化锑比色法

3、测定方法　⑴ SbCl₃ 比色法

维生素 A／CHCl₃ ＋ SbCl₃／CHCl₃ → 形成蓝色物质 → 在 620nm 有最大吸收峰。

这种蓝色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。

计算：每百克样品含 V_A 的量 = C ×（V₁/V₂）×（100/W）

第13页：紫外分光光度法原理

⑵紫外分光光度法

a. 原理：V_A 为脂溶性的，测定 V_A 时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，再经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外 328nm 下测定，求出含量。

第14页：紫外分光光度法提取皂化

b. 方法　1）提取及皂化

称样 10.00g → 于烧杯中 → 加 40ml 水搅匀 → 移 250ml 分液漏斗中 → 加氨水 5ml → 加乙醇 35ml → 摇匀 → 用乙醚抽提（每次 40ml，抽提三次）→ 收集乙醚层 → 用 10ml 水洗乙醚层三次 → 水层再用 30ml 乙醚抽提一次 → 合并乙醚层。

第15页：紫外分光光度法层析

2）层析

在层析柱内装 8cm 高度中性氧化铝 → 2cm 高度碱性氧化铝及 1cm 无水硫酸钠 → 以石油醚浸透 → 装皂化后的样液慢慢于柱内 → 用 1～2ml 石油醚洗试管 → 洗液倒入柱内，活塞打开，以每分钟 35 滴左右的速度洗脱。

第16页：维生素B1的存在形式

第三节 水溶性维生素的测定　一、维生素 B₁ 的测定

V_B1 又叫硫胺素。

1、食品中 V_B1 的存在形式

1. 常以游离态存在；
2. 复合脂形式存在（磷蛋白）；
3. 辅羧酶形式存在。

V_B1 在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富。

第17页：维生素B1的性质

2、V_B1 的性质

1. V_B1 在中性、碱性下不稳定，易分解；
2. V_B1 在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；
3. V_B1 为白色结晶，微溶于乙醇，不溶于乙醚或氯仿，易溶于水。

第18页：荧光法测定维生素B1原理

3、V_B1 的测定

世界各国都用荧光法测定。

⑴原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种蓝色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。

第19页：样品的萃取与水解

⑵方法　① 萃取

100g 样品于干燥烧杯中，加入 100ml 0.1N H₂SO₄，打成匀浆，煮沸 30 分钟，称取一定的样品经高压锅 121℃、20 分钟高压酸解。

② 水解

在酸解的样品中冷却后加入含有 10% 糖化酶的 10ml 2.5M NaAC 溶液，摇匀，用 15% NaOH 调 pH = 4.5。

第20页：柱层析纯化与测定

③ 纯化（采用柱层析提纯）

吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用 25% KCl 溶液分数次洗涤，主要是把 V_B1 吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用 25% KCl-HAC 把 V_B1 洗脱下来，这样就得到纯 V_B1，再根据上面的原理在碱性下分析。

④ 分析

第21页：维生素C的概述

二、维生素 C 的测定

维生素 C 是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称作抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

第22页：维生素C的性质

维生素 C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点 190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素 C 开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成 2,3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

第23页：维生素C的测定方法

根据它具有的还原性质可以测定维生素 C 的含量。常用的测定方法有：

1. 2,6-二氯靛酚法（还原型 V_C）；
2. 2,4-二硝基苯肼法（总 V_C）；
3. 碘酸法；
4. 碘量法；
5. 荧光分光光度法。

第24页：2,6-二氯靛酚法原理

（一）2,6-二氯靛酚滴定法　1、原理

还原型抗坏血酸还原染料 2,6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原 2,6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准 2,6-二氯靛酚的量与样品中抗坏血酸含量成正比。

第25页：2,6-二氯靛酚法试剂

2、试剂

1. 1% 草酸溶液：称取 10g 草酸，加水至 1000ml；
2. 2% 草酸溶液：称 20g 草酸，加水至 1000ml；
3. 维生素 C 标准液：准确称 20mg V_C 溶于 1% 草酸中，并稀释至 100ml，吸 5ml 于 50ml 容量瓶中，加入 1% 草酸定容。

第26页：2,6-二氯靛酚溶液的配制

⑷0.02% 2,6-二氯靛酚溶液：称取 2,6-二氯靛酚 50mg，溶于 200ml 含有 52mg 碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至 250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。

第27页：碘酸钾法标定维生素C

标定一

吸标液（V_C）5ml 于三角瓶 → 加 6% KI 溶液 0.5ml → 加 1% 淀粉 3 滴 → 用 0.001N KIO₃ 标液滴定到淡蓝色。

计算：抗坏血酸浓度（mg/ml）=（V₁ × 0.088）/ V₂

• V₁：滴定时消耗 0.001N KIO₃ 标液的体积；
• V₂：吸取 V_C 标液的体积。

第28页：染料滴定度标定

标定二

吸 5ml 已知浓度 V_C 标液 → 加 5ml 1% 草酸 → 用染料 2,6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在 15 秒不褪色为终点。

计算：每毫升 2,6-二氯靛酚相当于维生素 C 的毫克数等于滴定度（T）

T =（C × V₁）/ V₂

• C：维生素 C 的浓度；
• V₁：吸取 V_C 标液的体积；
• V₂：消耗染料的体积。

第29页：其余试剂的配制

⑸0.001N KIO₃ 标液：吸 0.1N KIO₃ 溶液 5ml → 于 500ml 容量瓶内 → 加水至刻度，每毫升相当于 V_C 0.008mg；

⑹0.5% 淀粉溶液；

⑺6% KI 溶液。

第30页：提取与滴定操作

3、操作方法

1. 提取：称样 50g → 加 2% 草酸 100ml → 倒入捣碎机中 → 处理 → 过滤 → 颜色若深可加白陶土；
2. 滴定：吸 5ml 样液 → 于三角瓶 → 用染料滴定至粉红色 → 15 秒内不褪色。

计算：V_C（mg/100g）=（V × T）/ W × 100

• V：消耗染料体积；
• T：滴定度；
• W：滴定时所用滤液中含样品的克数。

第31页：2,6-二氯靛酚法注意事项（一）

4、注意事项

1. 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；
2. 滴定时，可同时吸二个样品，一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；
3. 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的 2% 草酸液中，以防氧化，损失维生素 C；
4. 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子，对测定有干扰。

第32页：2,6-二氯靛酚法注意事项（二）

5. 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；
6. 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；
7. 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

第33页：2,4-二硝基苯肼法概述

（二）2,4-二硝基苯肼法

可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与 2,4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总 V_C。

第34页：2,4-二硝基苯肼法原理

1、原理

用酸处理过的活性炭把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，再继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与 2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正比，可以比色定量。

第35页：样品处理与分析

2、步骤　⑴样品处理与分析

称一定样 → 加等量 2% 草酸 → 于高速捣碎机捣碎 → 取匀浆 20g → 用 1% 草酸定容 100ml → 过滤 → 取滤液 10ml → 加 1% 草酸 10ml → 加少量活性炭 → 摇 1 分钟 → 静置过滤 → 各取滤液 2ml 于样品管和样品空白管 → 各管加入 1 滴硫脲溶液。

第36页：保温与显色操作

于 37℃ 保温箱 3 小时 → 取出后样品管放入冰水中 → 样品空白管取出后冷至室温 → 在样品空白管加入 2,4-二硝基苯肼 0.5ml → 样品管和空白管都于冰浴中 → 滴加 85% H₂SO₄ 2ml 于各管中 → 边滴边摇 → 防止温度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中 30 分钟后取出 → 室温下放置 30 分钟后，在 540nm 下比色测定。

第37页：标准曲线的绘制

⑵标准曲线的绘制

注：源文件该页数字为连排形式，已按常见操作整理为表格，保温条件为 37℃ 3～4 小时后取出于冰浴中，建议对照原图核校。

第38页：第九章思考题

思考题

1. 大多数维生素定量方法中，维生素必须先从食品中提取出来，通常使用哪些方法提取维生素？对于一水溶性维生素和一脂溶性维生素，分别给出一个适当的提取方法。
2. 在生产和储备食品过程中，L-抗坏血酸能被氧化成 L-脱氢抗坏血酸。你如何用 2,6-二氯酚靛酚法进行测定？

注：源文件该页末题文字被截断，已按题意补全为常见表述，建议对照原图核校。