10 第十章 维生素的测定.ppt

第1页：第十章 维生素的测定

Determination of Vitaminin Food食品分析与检验第十章维生素的测定

第2页：维生素测定概述

4.6.1 维生素的测定概述维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。

第3页：维生素的分类与生理功能

脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。维生素B1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：

第4页：维生素的分析方法

4.6.2 分析方法维生素的分析方法可分为以下几种：

• （1）涉及人体和动物的生物分析方法。
• （2）利用原生动物、细菌和酵母的微生物分析方法
• （3）分光光度法、荧光法、色谱、酶法和免疫等物理化学分析方法。

第5页：维生素A的测定方法

4.6.2.1 脂溶性维生素的测定

• 一、维生素A目前维生素A都是合成的，来源：
• （1）从动物肝脏中得到；
• （2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素）维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

第6页：比色法与紫外法的比较

对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。

第7页：维生素A的性质

• 1、维生素A的性质
• ⑴因有许多不饱和链，故见光易分解；
• ⑵在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；
• ⑶对碱稳定；

第8页：三氯化锑光度法原理

2. 测定方法2.1 三氯化锑光度法2.1.1 测定原理在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑作用可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其蓝色的深浅与维生素A的含量在一定范围内成正比，故可通过吸光度测定维生素A的含量。

第9页：样品萃取与皂化

2.1.2 测定步骤⑴样品用有机溶剂萃取脂类样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。⑵脂类的皂化脂类含有维生素和脂肪这两部分，通过皂化（50%KOH、无水C2H5OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

第10页：皂化的条件

皂化条件：（1）C2H5OH︰脂类= 8︰1；（2）皂化温度与时间：70℃、30分钟在皂化时可以加入抗氧剂焦性没食子酸，防止氧化。

第11页：三种皂化条件的回收率

目前皂化有三种情况：低碱= 脂肪︰KOH为1︰2.5的关系另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。低温（室温）中温（70℃±2℃）高温（100℃15min）低碱低碱低碱回收率不完全回收率46%回收率70%

第12页：不皂化物提取与柱层析

⑶提取：不皂化物和皂化物经水、乙醚萃取可得到不皂化物。⑷柱层析分离干扰物质采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。

第13页：维生素A与胡萝卜素的分离

维生素A与β-胡萝卜素分离：吸附剂：8份中性Al2O3和2份碱性Al2O3混合，装柱分离方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；b. 用乙醚洗VA。

第14页：三氯化锑比色法的计算

2.1.3 计算SbCl3比色法维生素A／CHCl3 ＋SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。计算：每百克样品含VA的量= C×（V1/V2）×（100/W）C ：从标准曲线上查得VA的量V1 ：CHCl3定容的量V2 ：测定所取样液体积

第15页：方法讨论：试剂检验与避光

说明及讨论

• （1）乙醚中是否含有过氧化物的检验方法
• （2）乙醇中是否含有醛的检验方法
• （3）三氯甲烷中是否含有分解产物2CHCl3 + O22HCl + 2CCl2O
• （4）所用氯仿不应含有水SbCl3+ H2O SbOCl + 2 HCl
• （4）维生素A 见光易分解，整个实验应在暗处进行

第16页：方法讨论：稳定性与适用性

说明及讨论

• （5）由于三氯化锑与维生素A 所产生的蓝色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。
• （6）三氯化锑腐蚀性较强，不能沾在皮肤上，用过的仪器应用盐酸浸泡而后清洗。
• （7）本法适用于维生素A 含量较高的样品。

第17页：紫外吸收光谱的产生

紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁。波长范围：100-800 nm.(1) 远紫外光区:100-200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm(3)可见光区:400-800nm250 300 350 400nm1234eλ可用于结构鉴定和定量分析。电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁;带状光谱。2 测定方法2.2 紫外分光光度法紫外吸收光谱的产生

第18页：朗伯-比尔定律

Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律 描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体

第19页：紫外分光光度法测维生素A

紫外分光光度法测定维生素A原理：VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。

第20页：维生素D的性质

二、维生素D1.维生素D的性质维生素D是类固醇的衍生物，具有维生素D活性的物质约10余种，在功能上可以防治佝偻病。其中最主要的是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙醇)。维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。

第21页：

第22页：维生素D的三氯化锑光度法

2. 测定方法2.1 三氯化锑光度法原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，并于500nm波长处有一个最大吸收，其呈色程度与维生素D含量成正比。维生素D／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→ 形成橙黄色物质→ 500 nm下测定

第23页：维生素D测定的说明

说明食品中维生素D含量一般较低，而其他维生素及物质含量大于维生素D，对测定产生干扰，测定前必须经柱层析除去这些物质。此法测定值为D2和D3的总量。

第24页：维生素D的紫外法与HPLC法

2.2 紫外分光光度法VD／乙醇→ 265 nm下测定2.3 高效液相色谱法（HPLC）基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性

第25页：维生素B1的存在形式

4.6.2.2水溶性维生素的测定

• 一、维生素B1的测定VB1又叫硫胺素
• 1、食品中VB1的存在形式
• ⑴常以游离态存在；
• ⑵复合脂形式存在（磷蛋白）；
• ⑶辅羧酶形式存在VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。

第26页：维生素B1的性质

• 2、VB1的性质
• ⑴VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；
• ⑵VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；
• ⑶VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

第27页：维生素B1的测定方法

3、VB1的测定世界各国都用荧光法测定

第28页：荧光与磷光的产生过程

• 一、荧光与磷光的产生过程1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第
• 一、第
• 二、…电子激发单重态S1、S2…；第
• 一、第
• 二、…电子激发三重态T1、T2…；

第29页：分子能级与跃迁图

S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l3外转换l 2T2内转换振动弛豫

第30页：激发光谱

二、激发光谱与荧光(磷光)光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；

第31页：荧光光谱

2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。

第32页：

第33页：荧光产生与分子结构的关系

• 三、荧光的产生与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件
• （1）具有合适的结构；
• （2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（ ）：

第34页：荧光定量的依据

2.定量依据与方法(1)定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：If= Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10- lc)If= I0(1-10- lc)= I0(1-e-2.3 lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 lc=Kc

第35页：荧光定量方法

（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度

第36页：维生素B1的荧光测定原理

VB1的测定原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。

第37页：维生素B2的特性

• 二、维生素B2的测定
• （1）VB2的特性（Properties of VB2）
• ①对热稳定，对酸和中性pH也稳定,在120 ℃加热6h仅少量破坏。
• ②在碱性条件下迅速分解。
• ③在光照下转变为光黄素和光色素,并产生自由基,破坏其它营养成分产生异味,如牛奶的日光臭味即由此产生。

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第39页：维生素C的测定概述

三、维生素C的测定维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

第40页：维生素C的理化性质

维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

第41页：维生素C的测定方法

根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有

• （1）2，6-二氯靛酚法（还原型VC）
• （2）2，4-二硝基苯肼法（总VC）
• （3）碘酸法
• （4）碘量法
• （5）荧光法

第42页：2,6-二氯靛酚滴定法原理

1. 2，6-二氯靛酚滴定法1、原理：还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

第43页：二氯靛酚法注意事项（一）

注意事项

• ⑴所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；
• ⑵滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；
• ⑶样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C；
• ⑸整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；
• ⑹在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；

第44页：二氯靛酚法注意事项（二）

⑷贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低价铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；⑺测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

第45页：2,4-二硝基苯肼法

2、2，4-二硝基苯肼法可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC。

第46页：二硝基苯肼法的反应原理

原理：用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正比，可以比色定量。

第47页：微量荧光法测维生素C

3. 微量荧光法原理：该方法用于测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，与邻苯二胺反应，形成具有荧光的喹恶啉化合物