页数：32页文件大小：590.5 KB来源： 食品分析ppt课件
本课件讲解食品中蛋白质与氨基酸的测定。先给出蛋白质元素组成与测定意义，介绍定性显色反应与氮蛋白换算系数；随后系统讲解凯氏定氮法的消化、蒸馏、吸收与滴定三步及影响因素，并展开双缩脲法标准曲线制作、福林酚法与杜马斯燃烧法及几种方法的比较；最后讲解氨基酸的甲醛滴定法、非水溶液滴定法与电位滴定法，并附酱油氨基酸态氮计算实例。
Determination of protein andamino acid in Food食品分析第九章蛋白质及氨基酸的测定
第一节概述1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）•C：50-55% N：15-18% O：20-23%•H：6-8% S：0-4%•微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、基本结构单位：氨基酸3、蛋白质的变性作用。
4、蛋白质分析的重要性•生物活性测定•功能性质调查•营养标签总蛋白质含量氨基酸组成蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法杜马斯法福林酚法染色法
第二节蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）
第三节蛋白质的定量测定关于氮-蛋白质换算等数6.25=6.25=6.38=5.95
一、凯氏定氮法常量凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定①消化2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O<1>加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点<2>加硫酸铜作为催化剂、消化终点指示剂<3>加氧化剂加速有机物氧化速度
②蒸馏NH4+ + OH-== NH3+H2O
影响氨化完全和速度的因素•（1）K氏烧瓶和取样量•（2）分解剂1g样品K2SO4：H2SO4= 7g : 12ml还有一种比例：K2SO4：H2SO4= 10g : 20ml
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿）指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）③吸收与滴定反应式为：NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-H2BO3-+H+==H3BO3<2> 用过量的H2SO4或HCl 标准溶液吸收，再用NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。
现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。讨 论大量的脂肪振摇大火加热消化2h后，估计消化完全量NaOH少
计算X=•X为样品中蛋白质的含量•V1为样品消耗盐酸标准液的体积•V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积•C为盐酸标准液的浓度•MN为氮的摩尔质量•W为样品的质量•K为氮换算为蛋白质的系数
二、双缩脲法NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2△150~160℃双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。紫色络和物。
| 管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 标准蛋白液/ml | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蛋白浓度/(mg/ml) | 0 | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 |
| 蒸馏水/ml | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 双缩脲试剂/ml | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| A540 | — | — | — | — | — | — |
取两组测定的 A540 平均值，以 A540 为纵坐标、蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
| 管号 | 0（空白） | 1（样品） |
|---|---|---|
| 样品稀释液/ml | 0 | 0.5 |
| 蒸馏水/ml | 1.0 | 0.5 |
| 双缩脲试剂/ml | 4.0 | 4.0 |
| A540 | — | — |
•取两组测定的平均值计算：•Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml）•N为稀释倍数•c为样品原浓度（mg/ml）。3、计算
福林-酚法（双缩脲法的发展）•两步反应(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
杜马斯法（燃烧法）样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
| 比较项目 | 凯氏定氮法 | 双缩脲法 | 杜马斯法 | 福林-酚法 |
|---|---|---|---|---|
| 原理 | 总氮量 | 蛋白氮 | 总氮量 | 蛋白氮 |
| 装置 | 凯氏定氮装置 | 分光光度计 | 高温装置、气相色谱仪 | 分光光度计 |
| 溶剂 | 浓硫酸 | 用量较少 | 不需要 | 福林-酚试剂 |
| 时间 | 长 | 简单快速，约3分钟 | 简单快速 | 简单快速 |
| 灵敏度 | 较低 | 低 | 高 | 高 |
| 干扰 | 较小 | 有干扰 | 较小 | 酸类及柠檬酸类 |
其他方法染色法紫外吸收法水杨酸比色法
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl当量浓度=0.1142N，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0ml，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5ml，空白的HCl溶液的毫升数=0.2ml，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。
第三节氨基酸定量测定
一、甲醛滴定法氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。
双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂同时取两份样①+中性红，用NaOH滴定②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定
溶剂选择原则
三、电位滴定法根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定的终点。pH8.29.2
测某样品中铁元素的含量，称样1.050g于坩埚中灰化，残渣用稀酸溶解后定容至100mL，吸取5mL样液于25mL容量瓶中显色、定容、测定，从标准曲线中查得样液中铁的含量为4.2μg/mL，请问该样品中铁元素的含量为多少？0.2%
在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL, 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2时，消耗标准碱液10.12mL,同法作空白实验，滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液0.08mL, 加入甲醛后滴定至pH9.2时，消耗标准碱液0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？0.301%你算对了吗？
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