08 蛋白质及氨基酸的测定.ppt

第1页：蛋白质和氨基酸的测定目录

蛋白质和氨基酸的测定

1. 概述
2. 凯氏定氮法
3. 氨基酸氮的测定

第2页：蛋白质概述的三个问题

1 概述

1. 食品中的蛋白质含量及测定意义
2. 蛋白质系数
3. 蛋白质测定方法

第3页：自学引导题

自学引导题

1. 蛋白质系数是如何计算出来的？
2. 蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？
3. 为什么说用凯氏定氮法测出的是粗蛋白的含量？

第4页：几种食品的蛋白质含量

（1）食品中的蛋白质含量（每100g中的克数）

第5页：蛋白质的测定意义

（2）蛋白质的测定意义

测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志。

第6页：蛋白质系数

（3）蛋白质系数

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种蛋白质的含氮量也不同；一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值6.25称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同：玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

第7页：凯氏定氮法与粗蛋白

（4）蛋白质含量测定最常用的方法——凯氏定氮法

• 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数求出蛋白质含量；由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，测定结果包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉及含氮色素等，所以这样的测定结果称为粗蛋白
• 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用普遍，是经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法
• 此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定

第8页：凯氏定氮法的分类

凯氏定氮法分为常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。

第9页：凯氏定氮法的原理

（1）原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵；然后加碱蒸馏使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量即可计算出蛋白质的含量。

自学引导：1、通过学习凯氏定氮法的原理，操作可分为哪几个大的步骤？2、加入硫酸钾、硫酸铜的作用是什么？

第10页：消化反应方程式

消化反应方程式

• 2NH₂(CH)₂COOH ＋ 13H₂SO₄ ＝ (NH₄)₂SO₄ ＋ 6CO₂ ＋ 12SO₂ ＋ 16H₂O
• 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；硫酸又具有氧化性，将炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：2H₂SO₄ ＋ C ＝ 2SO₂ ＋ 2H₂O ＋ CO₂
• 二氧化硫使氮还原为氨，本身被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中：H₂SO₄ ＋ 2NH₃ ＝ (NH₄)₂SO₄

第11页：蒸馏吸收与滴定的反应式

②蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏即可释放出氨气。

• 2NaOH ＋ (NH₄)₂SO₄ ＝ 2NH₃↑ ＋ Na₂SO₄ ＋ 2H₂O

③吸收与滴定：加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，待吸收完全后再用盐酸标准溶液滴定；因硼酸呈微弱酸性（K＝5.8×10⁻¹⁰），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用。

• 2NH₃ ＋ 4H₃BO₃ ＝ (NH₄)₂B₄O₇ ＋ 5H₂O
• (NH₄)₂B₄O₇ ＋ 2HCl ＋ 5H₂O ＝ 2NH₄Cl ＋ 4H₃BO₃

第12页：

第13页：样品消化

（4）测定方法——①样品消化

样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。

观察与思考：1、样品中加入浓硫酸后溶液的颜色立即发生什么变化？2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？4、如何判断消化的终点？

第14页：改进后的消化装置

改进后的消化装置（见原课件图示）：在消化管上连接气体吸收与回流部件，可减少消化过程中有毒气体的逸出。

第15页：微量定氮蒸馏装置

②蒸馏

按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶中加入10mL 40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。

思考：1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？2、加入数粒玻璃珠的作用是什么？

第16页：滴定与结果计算

③滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。

（5）结果计算：W ＝ c × (V₁ − V₀) × 0.014 × F × (100 / V₂) / m × 100

• W——蛋白质的质量分数，%
• V₀——滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL
• V₁——滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL
• V₂——蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL
• c——盐酸标准液的浓度，mol/L
• 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
• F——蛋白质系数
• m——样品质量，g

源文件该页未给出完整算式，此处按各符号含义补全，并以100mL定容体积计入稀释倍数。

第17页：样品的分解条件

2.3 样品的分解条件

1. K₂SO₄或Na₂SO₄：提高溶液的沸点
2. 催化剂：CuSO₄，Cu₂SO₄ ＋ 2H₂SO₄ → 2CuSO₄ ＋ 2H₂O ＋ SO₂↑；氧化汞和汞：良好的催化剂，但剧毒
3. 氧化剂：过氧化氢

第18页：硫酸钾的作用

硫酸钾的作用：加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度：

• K₂SO₄ ＋ H₂SO₄ ＝ 2KHSO₄
• 2KHSO₄ ＝ K₂SO₄ ＋ H₂O↑ ＋ SO₃

一般纯硫酸的沸点在340℃左右，添加硫酸钾后可使温度提高到400℃以上，原因在于随着消化过程中硫酸不断被分解、水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

• (NH₄)₂SO₄ ＝ NH₃↑ ＋ (NH₄)HSO₄
• 2(NH₄)HSO₄ ＝ 2NH₃↑ ＋ 2SO₃↑ ＋ 2H₂O

第19页：硫酸铜的作用

硫酸铜的作用

1. 催化剂：2CuSO₄ ＝ Cu₂SO₄ ＋ SO₂↑ ＋ O₂↑；C ＋ 2CuSO₄ ＝ Cu₂SO₄ ＋ SO₂↑ ＋ O₂↑；Cu₂SO₄ ＋ 2H₂SO₄ ＝ 2CuSO₄ ＋ 2H₂O ＋ SO₂↑。此反应不断进行，待有机物被消化完后不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色
2. 可以指示消化终点的到达
3. 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂

第20页：凯氏定氮的注意事项一

2.4 注意事项

1. 所用试剂应用无氨蒸馏水配制，加指示剂数滴及硫酸数毫升以保持水呈酸性
2. 若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫，应加入少量辛醇或液体石蜡或硅消泡剂防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度
3. 若样品消化液不易澄清透明，可加入300g/L过氧化氢2～3mL后再加热

第21页：凯氏定氮的注意事项二

4. 硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解；硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量
5. 若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量
6. 消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失，一般消化至透明后继续30分钟即可

第22页：凯氏定氮的注意事项三

7. 蒸馏过程应注意接头处无松漏现象；蒸馏完毕先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸
8. 硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱造成损失，可置于冷水浴中
9. 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色

第23页：氨基酸态氮测定的两种方法

氨基酸态氮的测定

双指示剂甲醛滴定法

原理、试剂、测定方法、结果计算、说明

电位滴定法

原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算

第24页：双指示剂甲醛滴定法的原理

4.1 双指示剂甲醛滴定法

（1）原理

氨基酸具有酸性的—COOH基和碱性的—NH₂基，它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐；当加入甲醛溶液时，—NH₂基与甲醛结合从而使其碱性消失，这样就可以用强碱标准溶液来滴定—COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。

反应式（有三种不同的推论）：RCH(NH₂)COOH ＋ HCHO → RCH(COOH)NHCH₂OH（或 RCH(COOH)N(CH₂OH)₂），再与NaOH作用生成 RCH(COONa)NHCH₂ 等产物。

第25页：双指示剂甲醛滴定法的操作

（4）操作方法

移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液mL数。

第26页：氨基酸态氮的结果计算

（5）结果计算：氨基酸态氮(%) ＝ c × (V₂ − V₁) × 0.014 / m × 100

• c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L
• V₁——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL
• V₂——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL
• m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g
• 0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol

源文件该页未给出完整算式，此处按各符号含义补全计算式。

第27页：电位滴定法的原理与仪器

4.2 电位滴定法

（1）原理

根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性；将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。

（2）仪器：酸度计（附磁力搅拌器）。

第28页：氢氧化钠标准溶液的标定计算

NaOH标准溶液的标定：c ＝ G / [(V − V₀) × 204.2 / 1000]

• c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L
• G——邻苯二甲酸氢钾的重量，g
• V——氢氧化钠溶液用量，mL
• V₀——空白试验氢氧化钠溶液用量，mL
• 204.2——邻苯二甲酸氢钾的分子量

源文件该页算式书写有误（写作连乘形式），此处按物质的量关系更正为上述计算式。

第29页：电位滴定的试验步骤

（4）试验步骤

1. 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL于烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）
2. 加入0.1mL甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗的毫升数
3. 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验

第30页：电位滴定的数据记录

（5）结果计算——①数据记录

• 加甲醛前耗NaOH量（mL）
• 加甲醛后耗NaOH量（mL）
• NaOH标准液浓度（mol/L）
• 样品滴定：1、2、3及平均
• 空白滴定：1、2、3及平均

第31页：氨基酸态氮质量浓度的计算

②计算：ρ ＝ c × (V₁ − V₂) × 14.01 × 100 / (1000 × V₃)

• ρ——氨基酸态氮质量浓度，g/100mL
• c——氢氧化钠浓度，mol/L
• V₁——加入甲醛后耗NaOH的量，mL
• V₂——空白试验加甲醛后耗NaOH量，mL
• V₃——测定用样品稀释液的量，mL
• M_氮——氮的摩尔质量，14.01g/mol
• 5——样品量，mL

源文件该页未给出完整算式；另「5」标注为样品量，与前面吸取20.0mL稀释液的操作不一致，实际计算应按标准方法核对取样量与稀释倍数。