第1页：有害物质测定的三项内容
食品常见有害物质的测定
- 概述
- 食品中有机磷农药残留量的测定
- 食品中黄曲霉毒素的测定
第2页：食品中常见有害物质的种类
食品中常见有害物质的测定——有害物质成分
- 农药、黄曲霉毒素、苯并芘、亚硝胺类化合物、苯酚、多氯联苯、动植物毒素、氰化物
- 重金属元素、非金属元素、添加剂、激素、抗生素、兽药
第3页：食品中农药残留量的测定
食品中农药残留量的测定
- 农药
- 农业生产中使用的各类农药，常用的有有机氯农药和有机磷农药2大类
- 农药残留
- 指未分解而留存于土壤、作物及环境，进而留存于食品的农药
- 测定方法
- 2003年新制定的《食品卫生检验方法》增加了42种测定农药的方法，用得较多的是气相色谱法，其次是高效液相色谱法、分光光度法
第4页：有机氯农药残留量的测定
一、有机氯农药残留量的测定（GB/T 5009.19—2003）
- 方法
- 第一法气相色谱法，第二法薄层色谱法
- 有机氯农药的提取步骤
- 有机溶剂（丙酮、石油醚）提取 → 净化 → 浓缩
第5页：有机磷农药残留量的测定方法
食品中有机磷农药残留量的测定
- GB/T 5009.20—2003
- 第一法：水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定，采用气相色谱法，可检测20种有机磷农药
- 第二法：粮、菜、油中有机磷农药残留量的测定，同样采用气相色谱法，可检测9种有机磷农药
两者区别：用不同的色谱分离柱- GB/T 5009.199—2003
- 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测：速测卡片（纸片法）、酶抑制率法（分光光度法）
- 适用范围
- 本法为定性检验方法，因为速度快而广泛使用
第6页：酶抑制率法的原理
- ⑴原理
- 胆碱酯酶底物（碘化硫代乙酰胆碱）＋显色剂（二硫代二硝基苯甲酸）→有色物质，pH 8.0
- 无农药
- 胆碱酯酶催化能力强，显色深
- 有农药
- 胆碱酯酶催化能力弱，显色浅，吸光度变化小，与对照溶液的吸光度差值大，抑制率大，农药含量高
⑵试剂 ⑶仪器
第7页：酶抑制率法的测定与判断
⑷测定步骤
- 样品处理
- 对照溶液的吸光度变化值测定：ΔA₀ ＝ A3min － A开始
- 样品液的吸光度变化值测定：ΔAt ＝ A3min － A开始
⑸结果计算与判断：抑制率（%） ＝ (ΔA₀ － ΔAt) / ΔA₀ × 100
若抑制率≥50%为阳性结果，抑制率越大，农药残留量越高。
第8页：黄曲霉毒素的有关知识
第二节 食品中黄曲霉毒素的测定——一、有关知识
- 黄曲霉毒素（AFT）
- 分类：AFT B、AFT G
- 特征
- 污染粮油及其制品；对光、热、酸稳定，对碱和氧化剂不稳定
第9页：黄曲霉毒素的结构与测定方法
- （2）结构特征
- 含二呋喃环、香豆素
- （3）测定方法
二、黄曲霉毒素B₁（AFT B₁）测定（GB/T 5009.22—2003）：第一法薄层色谱法，第二法牛清蛋白抗体反应显色法
第10页：薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理
薄层色谱法测定黄曲霉毒素B₁——1.原理
样品中AFT B₁经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B₁最低检出量产生的荧光强度比较，来测定样品中AFT B₁的含量。
第11页：薄层色谱法所用有机溶剂
2.试剂
- 三氯甲烷（AR）
- 正己烷（AR，沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）
- 甲醇（AR）
- 苯（AR）
- 乙腈（AR）
- 无水乙醚（AR）
- 丙酮（AR）
以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰。
第12页：混合溶液与吸附剂等试剂
- 苯-乙腈（98:2）混合溶液
- 甲醇-水（55:45）混合溶液
- 三氟乙酸（AR）
- 氯化钠（AR）
- 无水硫酸钠（AR）
- 硅胶G（薄层色谱用）
- 5%次氯酸钠：称取100g漂白精，加入500mL水，搅匀；另将80g工业用碳酸钠（Na₂CO₃·10H₂O）溶于500mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，用作消毒剂
第13页：黄曲霉毒素B1标准贮备液
- 黄曲霉毒素B₁标准贮备液
- 用百万分之一的微量分析天平精密称取1～1.2mg AFT B₁标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4℃冰箱中保存；使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10μg/mL
- 浓度标定
- 在350nm测定AFT B₁的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度
第14页：黄曲霉毒素B1标准应用液
- 黄曲霉毒素B₁标准应用液Ⅰ（1μg/mL）：吸取1.0mL 10μg/mL的黄曲霉毒素B₁标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容
- 黄曲霉毒素B₁标准应用液Ⅱ（0.2μg/mL）：吸取1.0mL 1μg/mL的标准应用液Ⅰ于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容
- 黄曲霉毒素B₁标准应用液Ⅲ（0.04μg/mL）：吸取1.0mL 0.2μg/mL的标准应用液Ⅱ于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容
第15页：薄层色谱法的主要仪器
3.主要仪器
- 玻璃板：5×20cm
- 涂布器
- 色谱展开槽（25×6×4cm）
- 紫外光灯：100～125W，带有波长365nm滤光片
- 微量注射器：20μL、10μL各一支
第16页：花生油样品的预处理
4.操作步骤——⑴样品预处理
称取4g混匀的花生油样品于小烧杯中，用20mL石油醚或正己烷将其转移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇-水溶液移入第二分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重复提取一次，提取液并入第二分液漏斗中。
在第二分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，振摇2分钟，静止分层后，放出三氯甲烷层，经盛有约10g先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷层一并滤入蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并入蒸发皿中。
在通风柜中，将蒸发皿于65℃水浴上挥干，然后放入冰盒上冷却2～3分钟，准确加入1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有结晶析出，将蒸发皿取下继续溶解、混匀，晶体消失后用滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。
第17页：薄层板的制备
- ⑵样品测定 1>薄层板的制备
- 称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量2～3倍左右的水，用力研磨1～2分钟，至成糊状后立即倒入涂布器内，推铺成5×20cm、厚度为0.25mm的薄层板三块；于空气中干燥约15分钟后，在100℃下活化2小时，取出放入干燥器中保存
第18页：薄层板的点样
- 2>点样
- 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3cm的基线上用微量注射器滴加样液和标准液
- 第一点：10μL 0.04μg/mL AFT B₁标液
- 第二点：20μL样液
- 第三点：20μL样液＋10μL 0.04μg/mL AFT B₁标液
- 第四点：20μL样液＋10μL 0.2μg/mL AFT B₁标液
要求点距边缘和点间距约为1cm，样点直径约3mm、大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。
源文件中样点直径写作约3cm，按薄层色谱常规应为3mm，此处更正。
第19页：薄层板的展开
- 3>展开
- 在展开槽内加10mL无水乙醚，将点好样的薄层板预展12cm，取出挥干；再于另一展开槽内加10mL丙酮＋三氯甲烷（8＋92）混合溶剂，展开10～12cm，取出挥干
第20页：薄层板结果的观察与判断
- 4>结果观察
- 将展开好的薄板放在365nm的紫外灯光下观察
- a. 若第一点无荧光或都无荧光：说明薄板或展开剂未制备好，需重新制备
- b. 第一点有荧光，而其余三点无荧光：说明样液中有荧光猝灭剂，样液需重新制备
- c. 第一点有荧光，第二点无荧光，三、四点有荧光：说明样液不含AFT B₁或含量小于最低检出量
- d. 四个点都有荧光：需做确证实验后再进行定量
第21页：黄曲霉毒素B1的确证实验
- 5>确证实验
- 于另一薄板上左边依次点两个样：第一点10μL 0.04μg/mL AFT B₁标液，第二点20μL样液；在以上两点各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反应5分钟后，用电吹风热风2分钟，使温度不高于40℃
- 右侧对照点
- 再于薄层板的右边点以下两个点：第三点10μL 0.04μg/mL AFT B₁标液，第四点20μL样液；同第3>步展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFT B₁标准点相同的衍生物AFT B2a，未加TFA的第三、四点作空白对照
源文件中右侧对照点标准液浓度写作0.04μg/L，按前后文与左侧一致应为0.04μg/mL，此处更正。
第22页：稀释定量操作
- 6>稀释定量
- 若第二点的荧光强度比第一点强，则根据其强度估计减少点样体积，于另一薄板上点四个点
- 第一点：10μL 0.04μg/mL AFT B₁标液
- 第二点：10μL样液
- 第三点：15μL样液
- 第四点：20μL样液
展开后取荧光强度与第一点相同的样点进行计算。
第23页：黄曲霉毒素B1的结果计算
5.计算：X ＝ 0.0004 × (V₁ × D) / (V₂ × m)
- X：样品中AFT B₁的含量，μg/kg（ppb）
- V₁：稀释前样液的总体积，mL
- V₂：出现同等荧光强度的稀释后样液点样量，μL
- D：样液的稀释倍数
- m：样品质量，单位为克（g）
源文件的符号说明中未列出 m，此处按标准方法补入样品质量符号及其单位。
第24页：
