08 第八章 微生物的遗传变异与育种.ppt

第1页：微生物学

微生物学

第2页：第八章微生物的遗传变异与育种

• 第八章微生物的遗传变异与育种
• 教学目标与要求：
• 掌握微生物遗传变异的机制和规律。
• 掌握微生物的突变，细菌的基因重组，并了解其在工农业生产和科研中的应用。
• 掌握微生物菌种复壮和保藏的基本知识与方法。
• 了解现代育种技术。
• 本章的难点：
• 微生物基因突变的机制和细菌的基因重组

第3页：第八章微生物的遗传变异与育种

• 第八章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础一、什么是遗传与变异遗传和变异是生物界最本质的属性之一。
• 遗传是亲代和子代生物学特性传递的过程，使亲代的特性在子代中重现。
• 遗传学是研究生物遗传机制的科学。

第4页：有关微生物的遗传变异现象

• 有关微生物的遗传变异现象，早在巴斯德时代就已开始了研究，如柯赫从患炭疽病的羊体中分离出了炭疽杆菌；巴斯德利用变异的炭疽杆菌制成了疫苗防治炭疽病等。
• 20世纪40年代起，由于细菌杂交试验的成功，使微生物遗传学有了飞速的发展，并一跃成为20世纪70年代后生物科学中发展最为迅速的学科之一。
• 微生物为什么是研究遗传学和生命科学有关基本理论问题的最好的对象和实验材料。
• 为什么说它为分子遗传学、分子生物学、生物工程等作出了巨大的贡献。

第5页：1、微生物的结构

• 1、微生物的结构较为简单，多数为单细胞或简单的多细胞，有的甚至是分子生物（如病毒，类病毒等）。
• 这样就使得遗传学的研究在分子水平上进行提供了可能和方便，从而推动和促进了分子遗传学与分子生物学的诞生和发展。
• 2、微生物营养体绝大多数是单倍体，核结构较为简单，核中DNA发生的变化，一般都能在遗传性状上表现出来。
• •它是分子生物学、分子遗传学等现代生物技术进一步研究和发展的有力工具。

第6页：微生物的繁殖速度快，传代时间短

• 3、微生物的繁殖速度快，传代时间短。
• （如：E.coli每20′即可繁殖一代）4、微生物的突变体容易被识别。
• 营养要求简单、易形成肉眼可见的菌落，环境条件对各个体的作用直接而均匀，存在着多种原始的进化类型等。
• 为分子生物学和分子遗传学的创立和发展提供了基础和依据。
• 微生物是分子生物学和遗传学研究中的明星。

第7页：有关遗传变异的几个基本概念遗传性

• 有关遗传变异的几个基本概念遗传性：是指亲代生物传给子代生物的一套实现与其相同性状的遗传信息，这种信息只有当子代个体生活在合适的环境条件下时，才能转化为具体的性状。
• 和一切生物一样，微生物的遗传性是相对稳定的。
• 变异性：凡是在遗传物质水平上发生了改变，从而引起某些相应性状发生改变的特性，称为变异性。
• 这种变异性是可以遗传的。
• 遗传性与变异性：。

第8页：基因型与表型：基因型

• •基因型与表型：基因型：又称为遗传型和因子型。
• 是生物体一切遗传基础的总和。
• 生物的遗传性具有其特定的物质基础。
• 在亲代传给子代的遗传物质中携带着它的全部遗传因子，即基因。
• 基因决定着生物的遗传类型。
• 表型：在合适的外界环境条件下，特定遗传型的个体通过新陈代谢和生长发育所表现出来的种种具体的性状。
• 就称为该生物的表型（又叫表现型、现象型）。
• 遗传型相同的个体在不同的环境条件下会呈现不同的表型。

第9页：注：表型的改变不能称为变异

注：表型的改变不能称为变异，它是不涉及遗传物质的结构或复制过程改变的变化（易发生于转录或转译水平上的暂时性的变化，又叫做饰变）。饰变：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。

第10页：举例：25℃——→深红色菌落（灵杆菌素）

举例：25℃——→深红色菌落（灵杆菌素）粘质赛氏杆菌（饰变）25℃——→深红色菌落（饰变）37℃——→无色素（表型的改变）25℃→无色素（遗传性变异）基因型的改变

第11页：表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性

表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）

第12页：二、核酸

二、核酸

二、核酸是遗传变异的物质基础

第13页：一）转化实验转化现象是由英国

• （一）转化实验转化现象是由英国的细菌学家格里菲斯在1928年首次发现的。
• 肺炎球菌是一种病原菌，存在着两种不同类型。
• 光滑型（Smooth）S型：SⅠ、Ⅱ、Ⅲ……（有荚膜、能使人和动物致病）肺炎球菌粗糙型（Rough）R型：RⅠ、Ⅱ、Ⅲ……（无荚膜、不使人和动物发病）格里菲斯的转化实验。

第14页：离体条件下的实验

离体条件下的实验：加热杀死的SⅢ——→不生长——→SⅢ×——→SⅢ、RⅡ各自保持着遗传特性——→RⅡRⅡ——→长出RⅡ在这里SⅢ菌已被加热杀死，当然不能死而复生。因此所分离到的活的SⅢ菌只能是RⅡ的变异菌株，而这又是在SⅢ型肺炎球菌的称为转化因子的物质的作用下发

第15页：①加S菌DNA ②加S菌DNA及DNA

• 加S菌DNA
• 加S菌DNA及DNA酶以外的酶
• 加S菌的DNA和DNA酶
• 加S菌的RNA
• 加S菌的蛋白质
• 加S菌的荚膜多糖活RⅡ菌长出SⅢ菌只有RⅡ菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死的SⅢ型中提纯了可能作为转化因子的各种成分，

第16页：二）噬菌体感染实验由于当时传统

（二）噬菌体感染实验由于当时传统的看法认为决定生物体内的遗传物质是蛋白质而不是DNA，因此完全有必要再次用实验证明DNA是遗传物质。细菌病毒T系列噬菌体感染寄主后的增殖过程?吸附→（注入）侵入脱壳→生物合成→装配→释放，包括五个连续的过程。

第17页：T2噬菌体在感染寄主的过程中

• T2噬菌体在感染寄主的过程中，蛋白质外壳吸附在寄主细胞的外表面，只有DNA核心才能侵入到寄主细胞内。
• 可是经增殖后的大量子代噬菌体都有着与亲代同样的蛋白质外壳，这就说明噬菌体的DNA可以决定病毒蛋白质外壳的生物合成。
• 1952年A.Hershey.和M.chase用示踪原子的方法，以E.coli T2噬菌体为实验材料，精确的证实了上述论点。

第18页：蛋白质外壳——>

蛋白质外壳——> S用放射性35S噬菌体标记核酸———> P同位素32P 2、噬菌体感染实验

第19页：噬菌体感染实验（1）含32P-DNA的一组

• 2、噬菌体感染实验（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。
• 实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。
• DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。

第20页：这就有力地说明亲代的蛋白质外壳

• 这就有力地说明亲代的蛋白质外壳的确没有进入菌体，没有参与子代噬菌体的增殖。
• 可是，最终从E.coli细胞中释放出来的却是一群完整成熟的与亲代有着同样蛋白质外壳的噬菌体颗粒。
• 这就一步证实了DNA是噬菌体遗传信息的载体。

第21页：三）病毒的拆开和重建实验有些病毒不含

• （三）病毒的拆开和重建实验有些病毒不含DNA，只含RNA，对这些病毒来说RNA是遗传物质。
• 1956年美国科学工作者H、Fraenkel_Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。
• 烟草花叶病毒中有许多不同的毒株，它们会对寄主（烟草）引起不同的症状，而且各种毒株间在其蛋白质中的氨基酸组分也各不相同。
• 这类病毒的蛋白质和RNA可以人为的拆开，同时又可将它们重新组合成新的有感染力的病毒颗粒。

第22页：这就充分说明，在RNA病毒中

这就充分说明，在RNA病毒中，遗传物质也是核酸，这里只不过是RNA罢了。以上三个实验得出一个共同得结论即：只有核酸才是生物遗传变异的物质基础。

第23页：三、DNA的结构

• 三、DNA的结构和复制除少数病毒的遗传物质是RNA外，其余各种生物的遗传物质都是DNA。
• DNA有着不同于生物体内其他物质的独特分子结构。
• DNA的基本单位是由杂环碱基、脱氧核糖、磷酸所构成。
• 碱基-糖的单位是核苷，核苷糖环上的C3或C5位置经磷酸化后，就转变成核苷酸。
• DNA是由许多核苷酸组成的磷酸二酯多聚体。
• 在DNA中有四种碱基：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。

第24页：碱基–腺嘌呤AdenineA–鸟嘌呤

碱基–腺嘌呤AdenineA–鸟嘌呤guanineGCT胸腺嘧啶thymine胞嘧啶cytosine

第25页：2.一个6位上

2.一个6位上

2.一个6位上是氨基的嘌呤必须和6位上是酮基的嘧啶相配对，而一个6位上是酮基的嘌呤必须和6位上是氨基的嘧啶相配对

第26页：DNA的双螺旋结构模型

• DNA的双螺旋结构模型
• DNA是由一条多核苷酸链同另一条多核苷酸链相配对，两条多核苷酸链彼此互补，排列方向相反，并以右手旋转的方式围绕同一根主轴而形成的双螺旋结构。
• 在DNA复制过程当中，两条多核苷酸长链由于其间氢键的断裂而彼此松开，随即各自以原有的核苷酸链为模版，根据碱基配对原则，吸收细胞中游离的核苷酸，按照原有链上核苷酸的排列顺序各自合成一条新的互补长链。

第27页：DNA这种独特的半保留复制方式,

DNA这种独特的半保留复制方式,不仅保证了生物遗传性的相对稳定，同时也为生物的多样性提供了可能，由此而创造了欣欣向荣的生命世界。

第28页：基因突变野生型（原始性状）基因突变突变型

• 基因突变野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）第二节微生物的突变微生物的变异基因重组突变就是由于生物体遗传物质中的核苷酸排列顺序发生变化而引起的遗传性状的改变。
• 突变基因突变（点突变）染色体畸变对微生物最为重要基因突变：是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的遗传性状的改变。
• 从发生突变的原因来看基因突变有自发突变和诱发突变（诱变）碱基置换移码突变。

第29页：一常用基因突变的符号和突变率

• 一常用基因突变的符号和突变率
• 常用基因突变的符号：每个基因座位用其英文单词的前三个字母的小写来表示，其座位上的不同基因突变则在三个小写字母后加一个大写字母表示，如hisA、hisB代表组氨酸的A和B基因；在三个字母的右上角可用不同符号表示微生物的突变型，如his＋、his－分别表示组氨酸原养型和缺陷型，gal＋、gal－分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖，strs、strr分别表示对链霉素敏感和具有抗性。
• 突变率:是指每一细胞在每一世代中发生某—性状

第30页：二基因突变的类型

• 二基因突变的类型1．形态突变型：指发生细胞形态变化或引起菌落形态改变的那些突变体。
• 如细菌的鞭毛、芽胞、荚膜或色素的有无，放线菌或真菌的产孢子情况和孢子颜色的变异，菌落形态的光滑（S型）或粗糙（R型）、大或小，以及菌落颜色的种种变异等2．条件致死突变型：温度敏感突变型就是一个典型的例子。
• 它们在亲代能生长的温度范围内不能生长，而只能在较低的温度下生长。
• 其原因常常是因为在它们体内某些酶蛋白的肽链中更换了几个aa,从而大大降低了它们抗热性的缘故。

第31页：3．致死突变型：由于基因突变

• 3．致死突变型：由于基因突变而造成个体死亡的突变型4．营养缺陷型（又称为营养突变型）：是生化突变型的一种。
• 指的是某种微生物经基因突变后，由于代谢过程中某种酶的丧失而成为必须添加某种营养成分才能正常生长的突变类型。
• 营养缺陷型的表示方法是：用所需生长因素的英文名词的前三个字母并在右上角加上负号表示。
• 如色aa营养缺陷型可用trpˉ来表示。
• 营养缺陷型的种类很多，有些可以自发产生，而更多的是可以人为地诱发产生。
• 营养缺陷型可通过选择培养法检出，是进行微生物遗传和变异研究的极为重要的实验材料。

第32页：5．抗性突变型：这

5．抗性突变型：这

这是一类抗药物，抗噬菌体、抗辐射等的突变体

第33页：三突变的发生

• 三突变的发生
• 在人们认识DNA是遗传物质以来，人们对突变的原因进行多方面的研究，其争议也较多，归纳起来不外乎两种观点：
• 1、微生物突变的原因与结果间相对应即是微生物对环境的适应而发生的；（一）基因突变的自发性和不对应性的证明2、微生物突变是自发的、偶然的、随机的和不定向的，而且与环境是不相对应的即突变的原因与结果间是不相对应的。由于其中有自发突变、诱变、诱变剂及筛选条件等的纠缠，所以难以探究问题的实质。从1943年起，通过几个严密的科学实验后，才使争议逐步解

第34页：变量试验：又称为波动试验和彷徨测试

1、变量试验：又称为波动试验和彷徨测试•是1943年由美国科学工作者鲁里亚和德尔波留克根据统计学的理论而设计的。Salvador LuriaMaxDelbruck

第35页：变量实验

变量实验（fluctuation analysis）

第36页：2涂布实验（1949年）

• 2涂布实验（1949年）
• 其方法简便易行，使用固体培养基。要点是：选用对T1噬菌体敏感的E.coli菌株，等量的涂布在12个平板上，培养5h后，平板上长出了大量微菌落。取其中6个平板用涂布器均匀涂布一遍，6个不涂布，然后同时喷上等量T1噬菌体。结果发现，涂布过的一组比未经涂布的抗性菌落要高得多。由此进一步说明，这是因为在接触T1噬菌体之前，这种抗性突变体已经出现，重新涂布将它们各自分开又各自形成菌落。
• 涂布试验进一步说明抗噬菌体突变体是发生在接触相应的噬菌体之前

第37页：平板影印培养试验

• 3、平板影印培养试验•1952年莱德伯格夫妇设计了一种更为巧妙的方法---影印培养法。
• 这个名称的由来是由于这个试验所采用的接种方法和一般的不同,采用类似打印或盖图章的方法进行接种。
• 印章的做法是取一块比培养皿略小的木块,一端用绒布包起来,。

第38页：通过影印培养试验令人信服地证实了微生物

• 通过影印培养试验令人信服地证实了微生物的突变是自发的产生,并与相应的环境因素毫不相干的论点。
• 突变的原因究竟是什么？
• 从这个试验更可以说明，抗药性突变并不是由于接触药物的结果。

第39页：四、突变

四、突变

四、突变是DNA分子中碱基对发生变化的结果（突变的机制）

第40页：基因突变及其机制

基因突变及其机制

第41页：一）碱基置换

（一）碱基置换：•是由于DNA分子中的碱基对置换引起的。包括转换和颠换是DNA分子的微小损伤

第42页：碱基置换引起的突变

碱基置换引起的突变

第43页：二) 自发突变

• (二) 自发突变：无人为因素下的低频率（约10－9～10－6）（1）背景辐射（2）有害产物积累（3）碱基错配:其中碱基本身的互变异构是导致碱基对置换的原因之一。
• 什么叫互变异构呢。
• 互变异构怎样引起碱基对置换呢。
• 下面以胸腺嘧啶T为例说明自发突变原因：。

第44页：T在一般情况下以酮式结构存在，但是

• T在一般情况下以酮式结构存在，但是在极少数的情况下，分子中N5位上的H能转移到C6上，从而使酮式转变为烯醇式，但是极快地通过H的移位，烯醇式又可恢复到酮式。
• 这种碱基分子结构上的相互转变称为互变异构。
• 由于互变异构，胸腺嘧啶本来与腺嘌呤（A）配对，但在转变为烯醇式的一瞬间，如果刚好DNA进行复制，T就不再与A配对而与G配对。
• 这样，当DNA再次复制时，通过G和C配对，就使A：T转变成G┇C。
• 而G┇C。

第45页：由于4个碱基均能以异构型存在

由于4个碱基均能以异构型存在，所以在DNA复制过程中，一个嘌呤可以被另一个嘌呤所替换，同样一个嘧啶也可被另一个嘧啶所替代;或者嘌呤被嘧啶、嘧啶被嘌呤所替代。-----碱基置换

第46页：三)诱发突变

• (三)诱发突变•突变可以通过诱导而加速产生。
• 凡能提高基因突变频率的因素统称为诱变剂。
• 诱变剂的种类很多，主要包括物理因素和化学因素。
• 1.物理因素：紫外线DNA对紫外线具有吸收能力,大剂量作用可致菌体死亡,小剂量则可引起突变.。

第47页：紫外线对DNA的损伤及

•紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体嘧啶水合物UV光复活作用嘧啶二聚体嘧啶光解酶

第48页：2、化学诱变剂的作用

• 2、化学诱变剂的作用常用的化学诱变剂有碱基结构类似物、亚硝酸、羟胺、烷化剂等。
• (1)、碱基类似物的代谢掺入5-溴尿嘧啶（5-BU）:这是一种能增加碱基对置换机率的化学诱变剂。
• 5-BU由于在结构上与碱基胸腺嘧啶（T）相类似，因此称为碱基类似物。

第49页：由于5-BU在结构与T相类似

• 由于5-BU在结构与T相类似，因此当微生物在含有5-BU的培养液中生长并合成DNA时，能以5-BU代替T，并且与A配对，通过代谢掺于到DNA分子中，从而引起碱基对的转换。5-BU掺入DNA这对细菌来说并无影响，问题在于5-BU也有酮式和烯醇式两种结构，并且出现烯醇式的频率更高，这样也就增加了A：T—>G┇C的机率。
• 象5-BU这类碱基代谢类似物既可造成突变又可产生回复突变。回变的概率与突变概率相等。

第50页：5-BU掺入而引起A：T→G┇C的过程

• 5-BU掺入而引起A：T→G┇C的过程：如果一个5-BU分子以酮式状态掺入到DNA的某一位置上，它就和A配对。
• 当这一DNA分子进行第二次复制时，如5-BU恰处于烯醇式状态，则它就只能和G配对。
• 到了第三次复制时，G有按常规与C配对。
• 这样，原有的A：T就转换成了G┇C,并随之带来某种性状的变异。
• 同样, 5-BU掺入也可以引起G┇C回复到A：T。

第51页：为什么象5-BU这类代谢类似物只有对正

•为什么象5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用。而对休止细胞，游离的噬菌体颗粒或离体的DNA分子却不起作用？

第52页：2）亚硝酸

• （2）亚硝酸：•亚硝酸是一类对含有氨基的碱基序列直接起作用,而诱发碱基对置换的化学诱变剂。
• 亚硝酸的作用是使DNA碱基中的氨基氧化脱氨，脱去的氨基被羟基取代，这样就使腺嘌呤（A）转变成次黄嘌呤（H）、胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U）。
• 而当A—>H和C—>U后，由于H和C配对，U与A配对，因此，当DNA再次复制时，A：T—>G┇C而G┇C → A:T。

第53页：

第54页：四）移码突变：移码突变是指DNA

（四）移码突变：移码突变是指DNA分子中多了或少了一～二个或少数几个碱基对而引起的碱基对顺序的改变。

第55页：以上的这个例子可以看出

• 以上的这个例子可以看出，下行由于多了一个碱基A，就使得插入位点后密码的顺序发生了改变，而氨基酸也发生了改变，而UAA又是无义密码子。肽链形成到异亮就断了，这样势必会导致微生物突变体的出现。
• 因此移码突变是由于DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增加或缺失，从而造成突变点以后的全部遗传密码的转录和转译发生错误，由这类突变产生的突变体称为移码突变。

第56页：五）染色体畸变：缺失、插入、重复、易位

（五）染色体畸变：缺失、插入、重复、易位、倒位

第57页：五、突变率

• 五、突变率
• 所谓突变率，就是每一个细胞在每一世代或每次分裂时所产生的突变频率。不同微生物或同种微生物，在不同情况下突变率是不同的。一般说来，自发突变率约为每个细胞每十万次到一亿次分裂产生一次突变，可用10-6---10-9表示每次细胞分裂的突变率。自发突变的机率虽不算高，但是微生物的繁殖能力极强，从这个角度看，发生突变的机率还是相当可观的。
• 在医学临床上，为了对付病原微生物可能出现的对抗药性的突变，往往考虑两种或更多的药物同时使用。

第58页：六、微生物突变的规律

• 六、微生物突变的规律1、不对应性：•突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
• 例如，细菌在有青霉素的环境下出现了抗青霉素的突变体；在紫外线的作用下，出现了抗紫外线的突变体；在较高的培养温度下，出现了耐高温的突变体等。
• 表面上看来，会认为是由青霉素、紫外线或高温的“诱变”，才产生了相对应的突变性状。
• 但事实上，这类性状都可通过自发的或其他任何诱变因子的诱发而获得。
• 以上的青霉素、紫外线、高温以及以前讲的变量试验和影印培养试验中的噬菌体和链霉素仅是起着淘汰和检出突变体的作用。

第59页：2．自发性：各种性状的突变

• 2．自发性：各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素的处理下自发地产生。
• 3．稀有性：自发突变虽可随时发生，但是突变的频率却是较低和稳定的，一般在10-6---10-9间。
• 但是某一微生物的某一特定性状的突变率却是一定的。
• 4．独立性：在群体上，各性状均可发生突变，而且这种突变彼此是独立的、随机的和不定向的。

第60页：5．诱变性：某些外界的物理

• 5．诱变性：某些外界的物理或化学因素可显著提高突变的频率。
• 一般可提高10～106倍。
• 不论是自变或是诱变所得到的突变型，它们之间并没有本质上的差别。
• 因为诱变剂仅是起着提高突变率的作用。
• 6．稳定性：由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新性状，也是稳定的、可遗传的。
• 7．可逆性(回复突变)：由原始的野生型基因，变异为突变型基因的过程为正向突变（正变）。
• 相反的过程则称为回复突变（回变）。
• 实验证明任何性状既有正向突变也可发生回复突变。
• 即回变的频率与突变的频率相同。

第61页：一）自发突变与育种：选育定向培育

（一）自发突变与育种：选育定向培育•是通过人工方法处理微生物,使之发生突变,并运用合理的筛选程序和方法,把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。1、诱变育种的基本环节（二）诱变育种七、突变与育种

第62页：诱变育种的原则诱变剂物理因素化学因素紫外

2、诱变育种的原则诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子烷化剂碱基类似物吖啶化合物（1）使用简便有效的诱变剂

第63页：8）根据具体情况创造新型筛选方案

（8）根据具体情况创造新型筛选方案（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量剂量=强度（浓度）×作用时间相对剂量=杀菌率（5）利用协同效应（6）寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案

第64页：突变株的筛选:（1）产量突变株的筛选

3、突变株的筛选:（1）产量突变株的筛选（2）抗药性突变株的筛选（3）营养缺陷型突变株的筛选

第65页：突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野

突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法

第66页：微生物突变体的筛选

• 微生物突变体的筛选•微生物的突变体在科研和生产上应用很广，但发生的机率较低，所以必须通过一定的方法进行筛选，才能获得。
• 这里只介绍青霉素浓缩法、菌丝过滤法和梯度培养皿法。
• 概念:（1）野生型——相对于突变体而言，是指在突变体发生变异前的原始菌株称为野生型菌株（原养型菌株）。
• 在其相应的基本培养基上生长，其遗传型应为[A＋B＋]（2）基本培养基——凡能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基，常以“[—]”表示；。

第67页：3）完全培养基——如果

（3）完全培养基——如果在基本培养基中加入一些富含aa、维生素和碱基之类的的天然物质（如蛋白胨、酵母膏等），就可满足该种微生物的各种营养缺陷型的生长，这种培养基就叫完全培养基，常用[＋]来表示（4）补充培养基——如果在基本培养基中具有针对性地只加上某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基称为补充培

第68页：诱变处理

• 1、诱变处理：
• 紫外灯（15W）照距（30cm）≥10～20″但不长于20″。取5ml单细胞或孢子悬液，于直径6cm的平皿中进行照射均匀有效，同时用磁力搅拌或其它方法均匀搅拌。2、淘汰野生型（浓缩缺陷型）：A）青霉素浓缩法
• 这种方法只适用于细菌。其原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因而能杀死生长繁殖着的细菌而不能杀死休止状态的细菌。如果将诱变剂处理后的细菌培养在含有青霉素的基本培养基中，就可以淘汰大部分生长繁殖活跃的野生型细胞而达到“浓缩”缺陷型的目的。

第69页：B）菌丝过滤法

B）菌丝过滤法•把霉菌或放线菌的孢子放在基本培养基中培养。由于在这种培养基里只有野生型菌株的孢子才能萌发，而营养缺陷型的孢子不能萌发，或虽然萌发，但不能长成菌丝体，所以接着通过菌丝过滤也能达到淘汰野生型而保留营养缺陷型的目的。C

第70页：检出营养缺陷型A）点种法

3、检出营养缺陷型A）点种法•把浓缩的菌液（细胞或孢子）在完全培养基上进行分离培养，然后将平板上出现的菌落逐个地点种到基本培养基和完全培养基上，经过一定时间培养后，凡是在基本培养基上不能生长，而在完全培养基上能生长的菌落，经复证后便是营养缺陷型。B）影印法C）夹层检出法D）限量补充培养基检出法4、鉴定缺陷型（常用生长图谱法）

第71页：①生长谱法

• ①生长谱法
• 方法简便；
• 回变和污染不影响结果
• 测定物质可为粉末或纸片缺陷型的鉴定：测定一般应分两阶段：
• 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；
• 第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；

第72页：②组合补充培养基法

②组合补充培养基法：–将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷类型，或快速分离出所需缺陷类型的菌株。ABFEDCHG

第73页：★缺陷型的应用

• ★缺陷型的应用
• 作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；
• 作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；
• 作为aa、维生素、碱基的测定菌株。

第74页：第三节细菌的基因转移和重组

• 第三节细菌的基因转移和重组
• 微生物的变异除了可以通过碱基发生变化而产生外，还可以通过微生物间的基因转移和重组而产生。所谓基因重组，就是一个生物细胞的基因与另一个生物细胞的基因进行重新排列。通过重新组合可以使微生物在不发生突变的情况下也可以产生新的遗传型个体。
• 在基因重组时，不发生任何碱基对结构上的变化。重组后生物体新的遗传性状的出现完全是基因重组的结果
• 真核微生物与原核微生物在基因重组的形式上有所不同。真核微生物的基因重组，在有性繁殖过程中发生。当真核微生物两个配子融合为一个合子并进行减

第75页：原核微生物的基因重组

• 原核微生物的基因重组，通常只是部分遗传物质的转移和重组，形成的是部分合子（半合子），并且通过转化，接合和转导等形式进行。
• 转化就是游离的DNA片段的转移和重组；
• 接合就是通过细胞与细胞间的直接接触而进行的遗传物质的转移和重组；
• 转导则是通过噬菌体携带而转移遗传物质的基因重组。

第76页：一、原核生物的基因重组供体菌受体菌DNA片段

一、原核生物的基因重组供体菌受体菌DNA片段1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力（一）转化转化是受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状。•进行自然转化，需要二方面必要的条件：

第77页：•自然感受态的出现

• 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；
• 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内1、建立感受态的受体细胞感受态细胞：凡是能吸收外来的DNA片段，并把它整合到自己的染色体组上以实现转化的受体细胞，叫感受态细胞（具有摄取外源DNA能力的细胞)。2、要有外源游离的DNA分子（即转化因子）
• 感受态是由受体细胞遗传性决定的，但是同时也受细胞的生理状态、菌龄和培养条件的影响。

第78页：来自供体细胞的具有转化活性的游离的DNA

• 来自供体细胞的具有转化活性的游离的DNA片段称为转化因子。在自然条件下，转化因子可以由于细菌细胞的解体而产生。当细菌细胞解体时，细胞中的DNA可以断裂为100个左右的片段，每一个片段至少有20个基因。在实验室内，转化因子可通过提取获得。
• 具有转化能力的DNA片段应该是双链的DNA片段，单链的DNA片段转化能力很弱，或者根本没有转化能力。这是由于单链DNA片段很难结合到受体细胞表面，而这一结合又是转化不可或缺的。

第79页：只有处于感受态的细菌才能接受转化因子

• 只有处于感受态的细菌才能接受转化因子。肺炎球菌的感受态出现在对数期的中后期，从出现到消失的时间约为40min，处于感受态的肺炎球菌每个细胞表面约有30～80个能结合转化因子的结合点。
• 当转化因子结合在受体细胞的结合点上时，DNA中的一个链可被受体细胞细胞膜上的核酸酶分解，而另一个链进入受体细胞，并且通过整合作用与受体细胞的DNA进行基因重组。其大体过程是这样的:

第80页：-------→

-------→

第81页：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性

噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染(transfection)：转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多

第82页：人工转化用CaCl2处理细胞

• 人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
• 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。
• 不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。
• 质粒的转化效率高。

第83页：二）细菌的转导（transduction

（二）细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中细菌转导的类型：普遍转导局限转导完全普遍转导流产普遍转导低频转导高频转导局限转导与普遍转导的比较溶源转变

第84页：三）接合(conjugation)

• （三）接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
• 1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm认为细菌的转化有些与高等动物、植物的接合相类似。
• 因此他们设计了一个实验来观察细菌是否存在接合现象。
• 中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。
• 用E.coli K12的两类营养缺陷型作为实验材料：E.coli K12的苏氨酸（thr－）、赖氨酸（leu－）的营养缺陷型和E.coli K12的生物素（bio－）、甲硫氨酸（met－）的营养缺陷型。
• 为了简化起见，这里分别用ABCD来表。

第85页：由于这两种营养缺陷型通过接合

• 由于这两种营养缺陷型通过接合，相互进行遗传物质的转移和重组，从而使双方的遗传特性发生改变。
• 为了排除这是由于转化的可能性，有人设计了U形管实验。
• 经过一段时间的培养，从U形管的两端取出的细菌都不能在基本培养基中生长。U形管实验充分说明了不让细菌接触，遗传物质就无法转移，因而否定了这是转化的结果。

第86页：后来，随着电子显微镜的广泛应用

• 后来，随着电子显微镜的广泛应用，科学工作者得到了E.coli接合的电子显微镜摄影图像，从而更进一步证实了细菌接合的客观存在。
• 从电子显微摄影图像上可以看到E.coli的接合与性纤毛有关。性纤毛是中空的，遗传物质可以通过性纤毛进行转移。不久又发现能进行结合的E.coli有和之分，而这些又取决于是否有F因子的存在。
• 凡有F因子的菌株，其细胞表面就产生1～4条中空而细长的丝状物，即性纤毛。有F因子的为性，即供体

第87页：F因子和接合

• F因子和接合•F因子又称为致育因子,这是一种存在于细菌染色体外的小型的独立的环状DNA单位，它具有控制本身复制和转移的到其它细胞中去的能力。
• 此外，在其上还带有一些对生命活动来说不是很重要的基因，能编码40～60种蛋白质。
• 一般每个细胞具有1～4个F因子。
• F因子为附加体的质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上。

第88页：F因子的四种细胞形式a）F-菌株

• F因子的四种细胞形式a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
• c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
• d）F′菌株，Hfr。

第89页：1）F+×F-杂交理化因子的处理可将F

• 1）F+×F-杂交理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。
• a）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；b）F+细菌的F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。
• c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。
• d）复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的。

第90页：Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上

• Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。
• 2）Hfr ×F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。
• 所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。
• F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。
• Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。

第91页：染色体上越靠近F因子的先导区的基因

染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率高。

第92页：中断杂交

中断杂交（interrupted mating）技术利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。

第93页：大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟）

大肠杆菌基因组很大（全部转移需要100分钟），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成

第94页：3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F

3）F′×F-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段细菌染色体基因的F因子，特称为F′因子。F′×F-与F+×F-的不同：供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；

第95页：二其它种类的质粒细菌的重组，除起主导作用的F

二其它种类的质粒细菌的重组，除起主导作用的F因子外，还有其它的质粒附加体能在细胞间传递。目前研究的较多的有R因子、大肠杆菌素因子和降解质粒等。

第96页：一）原核生物的质粒

（一）原核生物的质粒1、定义质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。

第97页：结构特点通常以共价闭合环状

2、结构特点通常以共价闭合环状(covalentlyclosed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）

第98页：3、质粒的主要种类质粒所编码的功能

3、质粒的主要种类质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）

第99页：1）致育因子(Fertility

• （1）致育因子(Fertility factor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。
• 携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。
• F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。

第100页：2）抗性因子（Resistance

• （2）抗性因子（Resistance factor，R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。
• 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。
• R质粒抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因。

第101页：3）产细菌素的质粒（Bacteriocin

（3）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）

第102页：4）毒性质粒（virulence

（4）毒性质粒（virulence plasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。

第103页：产毒素大肠杆菌

产毒素大肠杆菌

产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒

第104页：5）代谢质粒（Metabolic

• （5）代谢质粒（Metabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。
• 将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。
• 降解质粒：。

第105页：假单胞菌：具有降解一些有毒化合物

假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药、辛烷和樟脑等的能力。

第106页：6）隐秘质粒（cryptic

• （6）隐秘质粒（cryptic plasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。
• 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。
• 在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）。

第107页：质粒在基因工程中的应用质粒的优点

4、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体

第108页：第四节微生物的菌株选育

• 第四节微生物的菌株选育•微生物遗传变异的知识已被广泛地应用，其中在微生物菌株选育方面尤为突出。
• 菌种选育主要有诱变育种、杂交育种和遗传工程。
• 一、诱变育种就是用物理或化学因素处理微生物的细胞群体，促使其中极少数的细胞遗传物质的分子结构发生改变；从而引起微生物的遗传性发生变异，然后设法从群体中选出少数优良性状的菌株，以供科学实验或生产实践中使用。
• 诱变育种不仅可提高菌种的生产能力，而且还可以改进产品的质量，扩大品种和简化工艺；从方法来说它具有速度快、收。

第109页：二、杂交育种•基因重组

• 二、杂交育种
• 基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种是选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此不论在方向性还在自觉性上，都比诱变育种前进了一步。
• 另外，利用杂交育种往往可以消除某一菌株在长期进行诱变处理后出现的产量上升缓慢的现象。因此杂交育种是一种重要的育种手段。
• 但由于杂交育种的方法较复杂，工作进展比较缓慢，因此目前还难以象诱变育种那样得到普遍的推广和使用。

第110页：三、基因工程特点：可设计性、稳定性、远缘性

三、基因工程特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性（一）、基因工程定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。

第111页：获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因

获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用（二）、基因工程的基本操作

第112页：第五节菌种的衰退

第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡。

第113页：一、菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因

一、菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种自发突变不纯菌种突变个体传代增殖原始个体衰退菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状

第114页：1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来

• 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。
• a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。
• 菌种的复壮：。

第115页：二、防止衰退的措施1）减少传代次数

二、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；

第116页：三、菌种保藏目的：在一定时间内使菌种不死

三、菌种保藏目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用1、挑选典型菌种的优良纯种2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株基本原则：

第117页：基本方法培养基传代培养

基本方法培养基传代培养（斜面、平板）寄主传代培养低温（液氮、低温冰箱）干燥（沙土管、真空干燥）生活态休眠态

第118页：菌种保藏的方法

• 菌种保藏的方法很多，其原理：人为的创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活跃、生长繁殖受到抑制的休眠状态。
• 即从低温、干燥缺氧三方面设计。
• 一种好的保藏方法，首先应该能长期保持原种的优良性状不变，同时还需要考虑到方法本身的简便和经济。

第119页：思考题与复习题

• 复习与思考题
• 名词解释：遗传性与变异性基因型与表型饰变基因突变营养缺陷型自发突变转换颠换移码突变点突变突率野生型转化转导感受态细胞流产转导缺陷噬菌体接合F因子菌种复壮菌种保藏
• 试述证明核酸是遗传物质的3个经典实验，为何均选择了微生物作为研究对象？
• 试比较普遍性转导和局限性转导的异同。
• 试述基因突变的类型。5．变量实验与影印试验说明何问题？6．互变异构如何引起碱基置换？

第120页：7.试述微生物突变的规律

• 7.试述微生物突变的规律。
• 8．5-溴尿嘧啶（5-BU）碱基类似物的代谢掺入如何引起碱基置换。
• 9．请你设计筛选营养缺陷型突变体的方案。
• 10．试比较大肠杆菌中F因子存在的几种方式及常见的杂交结果。
• 11．何谓菌种退化。
• 12．试述菌种保藏的原理及方法。

第121页：①逐个检出法：缺陷型的检出

①逐个检出法：缺陷型的检出：

第122页：普遍转导

普遍转导（generalized transduction）噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导

第123页：

第124页：完全普遍转导

完全普遍转导

第125页：转导DNA不能进行整合、重组和复制

转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，在选择培养基平板上形成微小菌落流产普遍转导

第126页：局限转导温和噬菌体感染整合到细菌染色体

局限转导温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中

第127页：

第128页：温和噬菌体λ裂解时的不正常切割

温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。低频转导低频转导裂解物正常噬菌体

第129页：高频转导低频转导裂解物正常噬菌体极少量

高频转导低频转导裂解物正常噬菌体极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒三次感染，三次整合，一次切割，两次复制，两次裂解，两次转导高感染复数双重溶源菌缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制高频转导裂解物部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）正常噬菌体等量转导颗粒局限转导子（大量）低感染复数

第130页：局限转导与普遍转导的比较