页数：47页文件大小：10.93 MB来源： 细胞生物学ppt课件
本课件聚焦细胞形态结构观察技术：先讲普通光学显微镜的结构、成像原理与切片染色，再讲紫外光、暗视野、相差、微分干涉差、荧光与激光共聚焦等特殊光镜的原理，最后介绍电镜的分辨率突破、超薄切片与冰冻蚀刻制样以及扫描隧道显微镜。
Chapter 3-1 Techniques for Cell Biology：本讲介绍细胞形态结构观察技术，包括光学显微镜与电子显微镜两大类。
第一节 细胞形态结构观察技术。一、光学显微镜（一）普通光学显微镜。
2. 普通光镜的成像原理：光线经集光器聚光后穿过样品，由物镜与目镜两级放大成像（图中标注物镜镜口角 2α、图像与样品的倒立关系）。
在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易看清，往往需要将标本切片进行染色以提高可辨程度。流程包括：蜡或树脂包埋样品 → 切片机以钢刀切片 → 蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间 → 染色后观察。
染色的原理：利用染料与细胞成分的选择性结合增强反差。图中对比未染色与已染色标本的观察效果。
（二）特殊光学显微镜。1. 紫外光显微镜：以紫外线（波长介于 400 nm 与 X 射线之间）为光源，分辨率可提高 1 倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。
核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量。
暗视野聚光器的设计原理：视野的背景黑，物体的边缘亮。
利用这种显微镜能见到小至 5 nm 的质点，分辨率比普通显微镜高了 40 倍；有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。
光通过不同密度物质时滞留的时间不同，利用相差板将厚度的差别转化成明暗的差别，增加反差。
特点：在聚光器或光源上加了一环形光阑（annular diaphragm），在物镜中加了一环形相板（annular phase plate）。
相板上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后 1/4 λ 光程差。环形光阑使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。
图示相差显微镜的构造，重点为聚光器下方的环形光阑与物镜后焦面上的环形相板。
相差显微镜的光路图解：根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过；两组光线合轴后发生干涉现象。
两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）——结构比周围介质更加变暗。
如果为凹形相板：通过样品的光线延后 1/4 λ（−1/4 λ），与经相板环形区的直射光叠加后产生相减（S−D）效果。
则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）——标本结构比周围介质更加变亮。
如果为凸形相板：−1/4 λ 与 +1/4 λ 抵消后产生相加（S+D）效果。由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。
DIC 显微镜首先利用的是偏振光；此外除了物镜外，还增加了四个光学组件：偏振器（polarizer）、DIC 棱镜、DIC 滑行器和检偏器（analyzer）。
5. 荧光显微镜：图示荧光显微镜的成像原理——用特定波长激发样品中的荧光物质，检测其发射的荧光而成像。
免疫荧光技术：不同荧光染料标记抗体，与抗原（细胞的蛋白质成分）特异性结合。图示分裂细胞的免疫荧光图像。
二、电子显微镜：
分辨力（resolution）是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常用相邻两点间的距离表示，可通过公式换算：D = 0.61λ /（N·Sin α/2），其中 λ 为波长，N 为介质折射率，α 为物镜镜口角。
图示各种光及电子束的波长：电子束的波长远短于可见光与紫外光，因而可大幅提高显微镜的分辨率。
Ruska（1933~1938）便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）。
电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，其波长与发射电子束的电压平方根成反比——也就是说电压越高波长越短。
图示透射式电子显微镜（TEM）的整机结构与镜筒组成。
电子显微镜与光镜的成像原理比较：电镜以电子枪发射电子束，经电磁透镜聚焦，在高真空环境中成像于荧光屏。
电子显微镜与光镜的主要区别：
| 比较项目 | 电镜 | 光镜 |
|---|---|---|
| 光源 | 电子束 | 可见光 |
| 透镜 | 电磁透镜 | 玻璃透镜 |
| 聚焦方式 | 电磁聚焦 | 机械聚焦 |
| 切片厚度 | 超薄切片（0.05 µm） | 石蜡切片（1~10 µm） |
| 图像 | 黑白图像 | 彩色图像 |
源文件该页“图像”一栏仅提取到“图像”“彩色图像”两项文字，未明写电镜图像类型，此处按电镜成像的通行表述补全为“黑白图像”，建议对照原课件核对。
二. 主要电镜制作技术之一——超薄切片：以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度 20~50 nm，切片采用重金属盐染色。
2. 负染色：用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料、样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达 1.5 nm。
③ 蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂；然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜（replica）。
图示细胞冰冻断裂后的电镜图像，可见膜断裂面上分布的膜内颗粒（ intramembrane particles）。
电子枪发射出的电子束作为“探针”，在样品表面进行扫描；电子束激发样品表面放出次级电子，次级电子的多少与样品表面的结构有关，被带电荷的栅极收集后即向电子显像管发送信号，在荧光屏上相应位置显示出明暗差别。
当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变；将电流的这种改变图像化，即可显示出原子水平的凹凸形貌。
图示扫描式电子显微镜（SEM）的整机结构与成像系统。
图示扫描式电子显微镜的样品室与信号探测部分的结构示意。
图示耳听毛的扫描电镜图像，显示听毛表面凹凸的立体形貌。
三、扫描隧道显微镜：其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于“隧道效应”而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。
1981年 Binnig、Rohrer 等发明，荣获 1986 年诺贝尔奖；据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵。
分辨率：X-Y 向 0.1 nm（原子级分辨率）。
扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子（如 DNA、RNA 和蛋白质等）的原子布阵，也能观察一些生物结构（如生物膜、细胞壁等）的原子排列，而不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤——达到纳米科学水平。
第一节 形态观察技术小结：
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