页数：55页文件大小：10.23 MB来源： 细胞生物学ppt课件
本课件分为生物化学分析与实验性操作技术两部分：前者包括组织化学与细胞化学、免疫细胞化学、显微光谱分析、放射自显影、超离心、分子杂交、PCR 与层析技术；后者包括动植物细胞培养、显微操作术与单克隆抗体制备中的细胞融合。
Chapter 3-2 Techniques for Cell Biology：本讲介绍细胞的生物化学分析技术与其他实验性操作技术。
如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
常用的标记物有荧光素和酶：标记荧光素的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique），常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（rhodamine）等。
抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：
图示免疫荧光技术：不同荧光染料标记抗体，与抗原（细胞的蛋白质成分）特异性结合，分为直接免疫荧光（标记一抗）与间接免疫荧光（标记二抗）两种。
间接免疫细胞化学法的原理：
用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布状态：图中含 MPM-2 标记、DAPI 标记及 Merged 合并图像，对应分裂前期（Pro）、中期（Meta）、后期（Ante）、末期（Telo）等时相。
图示卤虫孵化腺细胞的 ELISA 染色照片（樊廷俊等，2003）。
三、显微光谱分析技术：细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱——核酸（260 nm）、蛋白质（280 nm）、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
细胞分光光度计（cytospectrophotometer）：
根据细胞成分所具有的特征吸收曲线，可利用它对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。
由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用 14C 和 3H 标记（14C 和 3H 均为弱 β 放射性同位素，半衰期长：14C 为 5730 年；3H 为 12.26 年）。
五、超离心技术：要研究细胞的各种结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究——离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。
各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决于颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。
式中 S 为沉降系数（秒）；R 为沉降颗粒到转头中心的距离（半径，cm）；ω 为角速度（以每秒转动的弧度表示）；t 为时间（秒）。
根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：
利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程：
流式细胞分选术（fluorescence-associated cell sorting, FACS）：细胞悬液在鞘液包裹下形成液滴，经激光照射与探测器检测，超声波振摇器使液滴断裂，加负电与加正电的液滴在电场中偏转，分别进入不同的细胞收集容器实现分选。
图示核酸杂交原理：待测核酸经变性解链后，与带标记的核酸探针退火复性，形成杂交双链。
在高 pH 值下，染色体 DNA 解链，带标记的核酸探针即可与染色体一定部位的互补单链 DNA 杂交。这种方法既可检测 DNA 序列，也可检测 RNA 序列；既可用放射性探针法，又可使用免疫探针法。
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）：图示 FISH 技术的原理——用荧光标记的核酸探针在细胞或染色体原位与互补序列杂交，实现特定序列的定位。
DNA chip（基因芯片）技术：将大量核酸探针高密度固定在芯片表面，通过一次杂交实现高通量、并行化的序列与表达检测。
经过 PCR 获得的大量 DNA 片断都是以原有的微量 DNA 片断为模板扩增而来，故此技术亦称为分子克隆技术（molecular cloning）。
图示 PCR 循环步骤：
八、层析技术——凝胶过滤柱层析：利用多孔凝胶按分子大小分离，分子量大者不能进入凝胶孔隙而先被洗脱，小分子后流出。
离子交换柱层析：利用带电分子与离子交换剂的静电结合差异进行分离，通过改变洗脱液的离子强度将不同组分依次洗脱。
亲和层析：利用固定化配体与目的分子之间的专一亲和作用（如抗原—抗体、酶—底物）实现高选择性分离纯化。
第二节 生物化学分析技术小结：
主要介绍几种对细胞进行整体或局部手术处理的技术，这些技术在细胞工程领域中有很重要的应用价值。
一、细胞培养：包括动物细胞培养与植物细胞培养两大类，是细胞工程与细胞生物学研究的基础技术。
1. 动物细胞培养：介绍原代培养、细胞系、细胞株与克隆等概念，以及常用的培养细胞系。
图示用倒置显微镜进行细胞观察的场景，可直接观察培养器皿中贴壁细胞的形态与生长状态。
通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系，为细胞生物学与生物医学研究提供了标准实验材料。
通过细胞培养已建立的大量细胞株或细胞系：
| 细胞系名称 | 细胞类型 | 来源 |
|---|---|---|
| 3T3 | 成纤维细胞 | 小鼠 |
| HeLa | 宫颈癌上皮细胞 | 人 |
| BHK21 | 成纤维细胞 | 叙利亚仓鼠 |
| PtK1 | 上皮细胞 | 袋鼠 |
| L6 | 成肌细胞 | 大鼠 |
| PC12 | 嗜铬细胞 | 大鼠 |
| SP2 | 浆细胞 | 小鼠 |
| SP2／0 | 骨髓瘤浆细胞 | 小鼠 |
| CHO | 卵巢细胞 | 中国地鼠 |
正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度；只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
2. 植物细胞培养最明显的特点是：
植物细胞培养大体有如下几种技术：
图示细胞显微解剖手术：固定吸管吸住细胞使之定位，注射吸管刺入细胞完成显微注射或其他手术操作。
三、细胞融合：介绍诱导细胞融合的三种方法以及单克隆抗体制备的杂交瘤技术。
目前诱导细胞融合的方法有三种：
单克隆抗体制备的杂交瘤技术流程：目的抗原免疫的小鼠 → 取其脾细胞（HGPRT+、TK+）与骨髓瘤细胞（HGPRT−、TK−）进行细胞融合 → HAT 筛选（只有融合的杂交瘤细胞因获得补救途径而存活）→ 抗体检测 → 克隆化 → 大规模培养 → 获得单克隆抗体。
第三节 其它实验性操作技术小结：
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