02 第二章 中药化学成分的一般研究方法.ppt

第1页：第二章 中药化学成分的一般研究方法

第二章 中药化学成分的一般研究方法（总论）

• 第一节 中药化学成分及生物合成简介
• 第二节 中药有效成分的提取方法
• 第三节 中药化学成分的分离方法

第2页：中药化学成分类型简介（一）

一、中药化学成分类型简介：本小节介绍各类成分的基本概念，重点掌握各类成分的一般溶解性，为理解提取、分离的一般方法打基础。

1 生物碱

为一类存在于生物体内、分子中含有氮原子的有机化合物的总称；一般具有碱性，可与酸成盐。游离生物碱具亲脂性，生物碱盐具亲水性。

2 苷类

为一类经水解后可产生糖和非糖两部分的化合物，非糖部分叫苷元。苷具亲水性，苷元具亲脂性。

3 挥发油

为一类可随水蒸气蒸馏出来的、与水不相混溶的油状液体的总称。具有香味或特殊气味的中药往往都含有挥发油，挥发油具亲脂性。

以上三类为主要的有效成分类型。

第3页：中药化学成分类型简介（二）

4 糖类

为中药中普遍存在的成分类型，包括单糖、低聚糖、多糖。单糖是糖的基本单位；低聚糖由2~9个单糖脱水缩合而成；多糖由10个以上至上千个单糖脱水缩合而成。

5 有机酸

广义指分子中有羧基的化合物，在植物中多以金属离子或生物碱盐的形式存在。小分子有机酸极性大、具亲水性；大分子有机酸极性小、具亲脂性。

6 树脂

为植物组织中树脂道的分泌物，性脆，受热先软化后变为液体，燃烧时发生浓烟并有明火，具亲脂性。按结构分为树脂酸、树脂醇、树脂烃三类。

7 氨基酸、蛋白质和酶

（1）氨基酸：分子中含有氨基的羧酸，构成蛋白质的多为α-氨基酸，为亲水性，在等电点时溶解度最小。

第4页：中药化学成分类型简介（三）

（2）蛋白质、多肽

蛋白质为二十多种α-氨基酸通过肽键首尾相连而成的高分子化合物。一般将分子量在5×10³以下称为多肽，介于5×10³~10⁷之间称为蛋白质。蛋白质在冷水中溶解且成胶体，在热水、60%以上乙醇及其它有机溶剂中变性沉淀。

（3）酶

是有机体内具有催化作用的蛋白质，催化作用具有专属性，如特定的酶可催化水解特定的苷；酶的性质和蛋白质相同。

8 鞣质

又称单宁或鞣酸，为一类分子较大、结构复杂的多元酚类化合物的总称，可与蛋白质结合成难溶于水的鞣酸蛋白，为亲水性物质。

9 植物色素

为植物中具有颜色的成分的总称，依溶解性分为水溶性色素（有颜色的苷、花青素）和脂溶性色素（叶绿素、胡萝卜素等）。

10 油脂和蜡

油脂为一分子甘油和三分子脂肪酸脱水结合形成的酯，主要在种子中，常温下为液体；蜡为高级不饱和脂肪酸和一元醇生成的酯，主要在植物茎、叶表面，常温下为固体。二者均为亲脂性成分。

第5页：各类成分溶解性对照表

各类成分在不同溶剂中的溶解性对照（＋表示可溶，－表示不溶或难溶，±表示部分溶解或条件性溶解）：

注：±表示条件性溶解——单糖对无水醇难溶；多糖对60%以上醇难溶；蛋白质、酶对热水沉淀、对60%以上醇沉淀。

第6页：主要生物合成途径（一）

二、中药化学成分的主要生物合成途径

（一）乙酸-丙二酸（AA-MA）途径

以乙酰辅酶A为起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。

1 酚和醌类

这类物质的生物合成过程中只发生缩合反应。乙酰辅酶A直线聚合后再进行环合生成各种酚类化合物；上述多酮环合则生成各种醌类化合物或聚酮类化合物。

（二）甲戊二羟酸（MVA）途径

起始物质为MVA，在ATP作用下按一定路线合成，萜类、甾类化合物均由这一途径生成。

第7页：甲戊二羟酸途径与莽草酸途径

甲戊二羟酸途径的产物

甲戊二羟酸（MVA）经甲戊二羟酸5-焦磷酸、焦磷酸异戊烯酯、焦磷酸二甲烯丙酯等中间体，最终生成萜类、甾类化合物。

（三）莽草酸途径

具有C6-C3及C6-C1基本结构的化合物由这一途径衍化生成。如由此途径生成的苯丙氨酸，经脱氨及氧化反应分别生成桂皮酸，再由桂皮酸、苯甲酸生物合成含C6-C3及C6-C1结构的天然化合物，如苯丙素类、木脂素类、香豆素类等。此途径也被称为桂皮酸途径。

第8页：氨基酸途径与复合途径

• 莽草酸途径示意：莽草酸 → 苯丙氨酸 → 桂皮酸 → 香豆素。
• （四）氨基酸途径：大多数生物碱类成分由此途径生成。鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等经脱羧成为胺类，再经甲基化、氧化、还原、重排等一系列反应生成各种生物碱。
• （五）复合途径：许多二级代谢产物由复合途径生成，即分子中各个部分由不同的生物合成途径产生。如查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成，再在各种酶作用下生成黄酮；一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。

第9页：溶剂提取法的原理

第二节 中药有效成分的提取方法：本节介绍中药化学成分的提取方法，主要介绍溶剂提取法。常用三种方法——溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法；新方法还有超临界提取法。

提取的概念

指用选择的溶剂或适当的方法，将所要的成分溶解出来并同中药组织脱离的过程。

一、溶剂提取法（一）提取原理

根据中药化学成分与溶剂间「极性相似相溶」的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据「浓度差」原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。

第10页：影响化合物极性的因素

（二）化学成分的极性：被提取成分的极性是选择提取溶剂最重要的依据。

1 影响化合物极性的因素

（1）化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。（2）取代基极性大小：在母核相同或相近的情况下，化合物极性主要取决于取代基极性大小。

常见基团极性大小顺序

酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。

举例：判断麻黄碱、蝙蝠葛碱等化合物的极性大小，依据上述两点一般即可判定；需要判断的大多数是母核相同或相近的化合物，此时主要依据取代基极性大小。

第11页：常见成分类型的极性比较

2 常见中药化学成分类型的极性

• 极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。
• 极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大分子有机酸、亲脂性色素。

以上不是绝对的，具体成分要具体分析，比如有的苷类化合物极性很小，有的苷元极性很大。

第12页：常用提取溶剂的极性顺序

（三）提取溶剂及溶剂的选择：1. 常用提取溶剂的分类与极性

• 分类：通常分三类——水类；亲水性有机溶剂；亲脂性有机溶剂。水类还包括酸水、碱水；亲水性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮；亲脂性有机溶剂为正丁醇以后的所有溶剂。
• 极性大小：水(H₂O)＞甲醇(MeOH)＞乙醇(EtOH)＞丙酮(Me₂CO)＞正丁醇(n-BuOH)＞乙酸乙酯(EtOAc)＞乙醚(Et₂O)＞氯仿(CHCl₃)＞苯(C₆H₆)＞四氯化碳(CCl₄)＞正己烷≈石油醚(Pet.et)。
• 互溶情况：水和亲水性有机溶剂可互溶，水和亲脂性有机溶剂间不互溶，有机溶剂间除甲醇和石油醚不互溶外其它均互溶。
• 极性大小的实质：介电常数不同，介电常数大的溶剂极性大，介电常数小的溶剂极性小。如己烷为1.9，氯仿为5.2，水为80。

第13页：水与乙醇作提取溶剂的特点

2. 提取溶剂的选择

选择原则

（1）要对所提取成分溶解度大，对杂质溶解度小；（2）要与所提取成分不起意外的化学变化；（3）要廉价、易得、安全。其中（1）是最主要的。

（1）水

极性最大的溶剂，也最常用。可溶解苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐，其中蛋白质不溶于热水。缺点：易酶解苷类成分且易霉坏变质；含果胶、粘液质类成分的水提取液常难过滤；沸水提取时淀粉被糊化增加过滤困难，故含淀粉量多的中草药不宜磨成细粉后加水煎煮。

（2）亲水性有机溶剂

以乙醇最常用，溶解性能比较好。除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖外，大多亲水性成分能在乙醇中溶解。优点：应用范围广、易过滤、不霉变、易浓缩回收。缺点：价高、不安全，需回流设备。

第14页：浸渍法、渗漉法与煎煮法

（3）亲脂性有机溶剂

选择性能强，用于亲脂性成分如游离生物碱、苷元、挥发油的提取。优点：提取专属性强，易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒，穿透性差，对设备要求高。

（四）提取方法

1 浸渍法

也叫冷浸法，将药材粗粉以适当溶剂在常温下浸泡，多以水类或稀醇为溶剂。适于成分遇热易破坏或含多糖较多的中药。缺点：浸出效果较差，水提取液易发霉，提取液体积大，浸出时间长。

2 渗漉法

将中药粗粉装于渗漉筒中，不断添加溶剂渗过药粉，从渗漉筒下端不断流出渗漉液，各类溶剂均可。由于溶液浓度差大，浸出效果好且不破坏成分。缺点：溶液体积大、时间长。

3 煎煮法

中药水提取最常用的方法，将中药粗粉用水加热煮沸保持一定时间，成分即可浸出；必须以水为溶剂，提取效率高，但遇热易破坏的成分要注意，含多糖多的成分过滤困难。

第15页：回流法与影响提取效率的因素

4 回流法

用于以有机溶剂加热提取成分，优点为提取效率高，但受热易破坏的成分不宜用此法；缺点为溶剂消耗量大，需回流设备，需几次提取方可提取完全。

5 连续回流法

以索氏提取器（亦称脂肪抽出器）回流提取，克服了回流法溶剂需要量大、需几次提取的缺点；缺点为提取时间长，受热破坏的成分不能用此法。

（五）影响提取效率的因素

• 1 药材粉碎度：药粉越细、表面积越大，提取效率越高；但太细药粉对成分的吸附也越强。水提取宜用粗粉，用有机溶剂可细些，以20目为好。
• 2 提取温度：一般热提效率高，但要考虑有些成分温度高易破坏，应选择适宜温度。
• 3 提取时间：一般提取时间长提出量大，但被提成分在细胞内外溶解一旦平衡，时间长即无意义。一般热水提以1/2~1小时为宜，乙醇提1小时为宜。

第16页：

第17页：水蒸气蒸馏法与升华法

二、水蒸气蒸馏法

适于具有挥发性、可随水蒸气蒸馏不被破坏、与水不反应且与水分层的成分的提取。中药中主要用于挥发油、某些挥发性生物碱、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元的提取。装置有两种：水蒸气蒸馏装置与共水蒸馏装置。

三、升华法

中药中的某些固体成分在受热低于其熔点的温度下，不经液态直接成为气态，经冷却后又成为固态，从而与中药组织分离，这种性质称为升华，这种提取方法称为升华法。中药成分有少量具有升华性，如游离羟基蒽醌类成分、一些小分子香豆素类、有机酸类成分等。

第18页：超临界流体提取法概述

四、超临界提取法（SFE）

1 特点

与经典溶剂提取法比较，不用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体（SF）的物质替代有机溶剂提取。

2 优点

（1）可在低温下提取，「热敏性」成分尤其适用；（2）无溶剂残留，对作为制剂的中药提取物的提取是一大优势；（3）提取与蒸馏合为一体，无需回收溶剂；（4）具选择性分离。

3 超临界流体（SF）

指处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上、介于气体和液体之间、以流动形式存在的物质。此时其流体密度近似液体、黏度近似气体，扩散力比液体大增，介电常数随压力增加而增加，浸透性优于液体，因而比液体有更佳的溶解力，特别有利于性质不稳定、易热分解物质的提取。

第19页：二氧化碳超临界流体的溶解规律

• 4 常见的SF：二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨、二氯二氟甲烷等，其中最常用的是二氧化碳。CO₂特点：临界温度接近室温（Tc=31.3℃），临界压力较低（Pc=7.37MPa），无色、无毒、无味，不易燃，化学惰性，廉价，易制成高纯度气体。
• 5 CO₂-超临界流体的溶解能力规律：取决于溶质的极性、沸点、分子量。
• （1）对亲脂性、低沸点成分溶解能力强，如挥发油、烃类、醚类、酯类等。
• （2）成分极性基团（如OH、COOH）越多越难提取，如糖类、氨基酸的萃取压力要4×10⁴Pa以上。
• （3）成分分子量越大，越难提取。

第20页：两相溶剂萃取法

第三节 中药化学成分的分离方法：本节介绍一般分离方法，有萃取、沉淀、结晶、盐析、膜分离、柱色谱等方法，重点掌握前三种和柱色谱法。

一、两相溶剂萃取法：1 原理

利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离。溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相，各成分在两相中分配系数相差越大，分离效果越高。

2 方法：1）简单萃取法

实验室用分液漏斗或下口瓶，一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，也可用酸水或碱水。中药成分复杂，一般一次萃取分离不出纯品，需配合其他方法。

破坏乳化的方法

（1）加热敷；（2）将乳化层抽滤；（3）长时间放置（24小时以上）。

第21页：pH梯度萃取法与沉淀法

2）pH梯度萃取法

分离酸性或碱性成分的常用方法。以pH成梯度的酸水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱性成梯度的混合生物碱，或以pH成梯度的碱水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的酸性成梯度的混合酚、酸类成分，使后者分离。

3）连续萃取法

采用连续萃取器萃取，利用两溶液比重不同自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质，可克服用分液漏斗多次萃取操作的麻烦。

4）液滴逆流分配法（DCCC法）

利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。

二、沉淀法

指于中药提取液中加入某些试剂或溶剂，使某些成分沉淀而使所要成分与杂质分离的方法。

第22页：沉淀法的四种类型

1 水醇沉淀法

（1）水提取醇沉淀法：于水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达60%以上，可使多糖、蛋白质沉淀。（2）醇提取水沉淀法：于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分。

2 铅盐沉淀法

利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离。中性醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基和羧基的成分；碱式醋酸铅沉淀范围较广，可沉淀含酚羟基和羧基及中性皂苷等。沉淀为杂质可弃去，沉淀为所要成分则可悬浮于水或稀醇中，通H₂S气体或加入稀H₂SO₄、Na₂SO₄等脱铅。

3 酸碱沉淀法

（1）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。（2）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。

4 专属试剂沉淀法

某些试剂能选择性沉淀某类成分，如雷氏铵盐沉淀水溶性生物碱，胆甾醇沉淀甾体皂苷使其与三萜皂苷分离，明胶沉淀鞣质用于分离或除去鞣质。

第23页：盐析法与结晶法操作

三、盐析法

于中药水提取液中加入某些无机盐至一定浓度或达到饱和状态，可使某些成分由于溶解度降低而沉淀析出。常用的无机盐有NaCl、Na₂SO₄等。

四、结晶法：1 结晶与重结晶的概念

结晶是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程，重结晶指由纯度低的结晶处理成纯度高的结晶的操作过程，二者从操作角度的差别是起始物不同。

2 结晶和重结晶操作流程：提取或分离物 → 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 → 溶液 → 放置（冷藏）析晶，过滤 → 粗结晶 → 重复上述操作（重结晶）→ 结晶。

注：源文件中盐析法常用无机盐写作「HCl」，按盐析法原理应为氯化钠等中性盐，此处按标准表述记为NaCl、Na₂SO₄。

第24页：影响结晶的因素

3 影响结晶的因素

1）结晶用溶剂的选择

最重要因素之一，应符合：（1）对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小；对杂质或冷热时都溶解，或冷热时都不溶解。（2）与被结晶成分不发生化学反应。（3）沸点不宜太高。中药成分的结晶常用一定比例的混合溶剂。

2）纯度

纯度越高越易结晶。

3）被结晶成分的类型

分子小易结晶；分子大、含糖多不易结晶。

4）溶液浓度

溶液浓结晶快，但结晶细碎、杂质多；反之结晶慢，但晶形大、纯度高。

5）结晶温度和时间

温度低、时间长，结晶好。

第25页：膜分离法

五、膜分离法：利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液中的化学成分进行分离、分级、提纯和富集。

• 反渗透、超滤、微滤、电渗析为四大已开发应用的膜分离技术，其中反渗透、超滤、微滤相当于过滤技术。
• 溶剂、小分子能透过膜，而大分子被膜截留；不同膜过滤被截留的分子大小有区别。
• 运用超滤并选用适当规格的膜，可实现对中药提取液中多糖类、多肽类、蛋白质类的截留分离。
• 透析法也属于膜分离法。

第26页：硅胶、氧化铝与聚酰胺柱色谱

六、柱色谱法：1 吸附柱色谱——利用吸附剂对被分离化合物分子吸附能力的差异而实现分离。

1）硅胶、氧化铝柱色谱

二者均为最常用的吸附剂。硅胶是中等极性的酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析；氧化铝有弱碱性，主要用于碱性或中性亲脂性成分如生物碱、甾、萜类等的分离，对生物碱类分离颇为理想，但碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型化合物的分离。吸附柱色谱行为与化合物的极性有关。

2）聚酰胺柱色谱

与化合物间主要为氢键吸附，主要用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质类等成分的分离。吸附规律：①能形成氢键的基团（酚羟基、羧基、羰基）多者吸附强；②基团数目相同时，处于对位和间位的吸附力强于邻位；③芳香环和双键多者吸附力强。

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第29页：大孔吸附树脂的结构与特性

3）大孔吸附树脂

（1）结构与组成

为白色或淡黄色球形颗粒状，粒度多为20~60目。组成为苯乙烯-二乙烯苯或α-甲基丙烯酸酯型，其中苯乙烯-二乙烯苯型为非极性树脂，2-甲基丙烯酸酯型为中极性树脂。结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构。

（2）特性

①理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂；②对有机物选择性较好；③吸附速度快；④再生处理方便。

（3）吸附原理

①吸附性：由范德华力或氢键吸附的结果；②筛性原理：由树脂本身的多孔性所决定。

第30页：大孔吸附树脂的洗脱与活性炭

（3）影响大孔吸附树脂分离效果的因素

①化合物分子极性大小：大孔树脂的色谱行为具有反相性质，被分离物质极性大者先流出色谱柱；②分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。

（4）洗脱剂

对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小洗脱能力越强；对中极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大的溶剂洗脱力强。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。

4）活性炭

是一种非极性吸附剂，对非极性物质吸附强，主要用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些苷。活性炭的吸附作用在水中最强，在有机溶剂中则较弱，故水的洗脱能力最弱，有机溶剂则较强。

第31页：正相与反相分配柱色谱

2 分配柱色谱：利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同而达到分离，按固定相与流动相的极性差别分为正相与反相色谱法。

正相分配色谱法

流动相的极性小于固定相极性，常用固定相有氰基与氨基键合相，主要用于分离极性及中等极性的分子型物质。

反相分配色谱法

流动相的极性大于固定相极性，常用固定相有十八烷基硅烷（ODS）或C8键合相，流动相常用甲醇-水或乙腈-水，主要用于分离非极性及中等极性的各类分子型化合物。中药中的各种苷类特别适合用反相色谱法分离。

反相色谱是应用最广的色谱法，因为键合相表面的官能团不会流失，流动相极性可在很大范围调整，再加之由其派生的反相离子对色谱法和离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。高效液相色谱（HPLC）最常用的即是反相填料。

第32页：凝胶过滤色谱

3 凝胶过滤色谱：原理主要是分子筛（或反筛子）作用，根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小而达到分离目的。

• 凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质。比凝胶孔隙小的分子可自由进入凝胶内部，比凝胶孔隙大的分子只能通过凝胶颗粒间隙。
• 分子大的物质不被迟滞（排阻），保留时间较短；分子小的物质向孔隙沟扩散、移动被滞留，保留时间较长，从而达到分离。
• 中药中多糖类、蛋白质、苷和苷元的分离可用凝胶色谱。
• 商品凝胶种类很多，常用的是葡聚糖凝胶(Sephadex G)和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)。

第33页：离子交换色谱

4 离子交换色谱

原理

离子交换反应的原理是树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水、碱水为流动相，流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合的溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来。

应用

中药中的碱性成分可用阳离子交换树脂交换，酚、酸性成分可用阴离子交换树脂交换，然后将交换后的树脂通过调整酸碱环境使吸附物游离，选择适当溶剂将吸附物溶解出即可。

分离依据

由于被交换的混合物成分的酸性或碱性不同而解离度不同，与同一离子交换树脂的交换能力不同而被分离。

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