页数：95页文件大小：4.60 MB来源： 医学遗传学ppt课件
本课件讲解遗传病的诊断与治疗，先说明基因诊断的概念、优势及与传统表型诊断的区别，区分直接基因诊断与间接基因诊断的原理，列举常用基因检测技术及其在症状前诊断、产前诊断中的应用，最后介绍基因治疗的概念、途径、基因转移方法与靶细胞选择原则。
第十章遗传病的诊断与治疗
本章内容第一节基因诊断概念及应用技术第二节基因诊断方法及实例第三节基因治疗
二、基因诊断技术Southern-blotNorthern-blot
点样Probe-32P检测AB1 2 3 4斑点杂交或等位基因特异性寡核苷酸基因诊断技术
基因诊断技术荧光原位杂交
基因诊断技术
基因诊断技术荧光原位杂交
基因诊断技术聚合酶链式反应
基因诊断技术1多重PCR在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失E1 E2 E3以PCR为基础的基因诊断技术
基因诊断技术2 RT-PCR以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度3实时定量PCR（real-time PCR）4 PCR-DGGE
基因诊断技术5 PCR-SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。
基因诊断技术---------------------------primer---------------------------↓ 32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳↓ 1 2 3 4 5自显影↓ 1为正常结果分析2、4、5为纯合患者3为杂合子.PCR-SSCP技术应用举例：
基因诊断技术生物芯片
筛查基因突变的方法比较缺点优点方法费力，费时，消耗DNA多大的缺失和重排Southern-blot适用于200bp以内DNA片段突变筛查，不显示突变位置简单、廉价PCR-SSCP昂贵检测杂合子及缺失定量PCR设备昂贵，不能显示突变位置迅速，高通量，定量dHPLC昂贵高通量，突变可定性测序、芯片
第二节基因诊断方法及实例直接诊断——直接检测致病基因的突变基因突变类型——缺失、点突变、重复、插入等间接诊断——应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体而间接地作出诊断利用遗传标记DNA多态——RFLP、VNTR、SNP
直接基因诊断及实例直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern杂交，或通过PCR扩增产物（或酶切），以检测基因点突变、缺失、插入等异常性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。
直接基因诊断—突变型遗传病的直接基因诊断镰形细胞贫血的基因诊断---点突变A. Southern blotMstII识别CCTGAGG突变为CCTGTGG后不能识别，限制酶切片段长度发生变化MstII
B.等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。NormalβΑGene Probe——与正常βΑ稳定杂交Mutation βSGene Probe——与异常βS稳定杂交
斑点杂交结果Ⅱ2的基因型？
BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe1） 地中海贫血的基因诊断 基因不同程度的缺失可引起不同类型的 地中海贫血。直接基因诊断—缺失型遗传病的直接基因诊断
Southern-RFLP检测β地贫 地中海贫血→ 珠蛋白基因部分缺失
DMD的基因诊断DMD属XRDMD基因是最大的致病基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失型遗传病的直接基因诊断
病例外显子1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失型遗传病的直接基因诊断
三、间接基因诊断方法及实例当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病基因本身尚未知时，主要通过DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。
Southern blot--RFLP诊断(PKU)PAH基因两侧有MspⅠ酶切位点;用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段;以PAH cDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断
以3´HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行SouthernBlot。基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊断
1 21 2 3 4 55.7kb3.4kb2.3kb间接基因诊断
结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断
本页为表格页，源文件提取文字存在粘连，表格结构待人工还原。
间接基因诊断甲型血友病→FVIIIBclI多态片段已知甲型血友病为XR，获得家系成员基因组DNA,PCR产物为142bp，经BclI酶切，产物：142bp、99 bp、43bp，电泳结果分析。甲型血友病诊断（PCR—RFLP）系谱1
间接基因诊断II1→99bp→其母(I2)的99bp片段与缺陷基因连锁，142bp片段与正常基因连锁；其父(I3)→142bp片段与正常基因连锁∴II2为携带者；II3为正常。
142bp99bp1 2123ⅠⅡIII1间接基因诊断---甲型血友病系谱211
结果分析1）先证者II1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段；如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；如果是女性为携带者（来自父母双方）。间接基因诊断
PCR-VNTR
征
核型分析
FISH分析
FISH分析
PCR分析
荧光定量PCR
第三节基因治疗
本章重点内容提示本节内容基因治疗(gene therapy)体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应
Germlinevs.Somatic gene therapy生殖系基因治疗：将治疗的靶基因导入生殖细胞，导入的基因将传递给后代。目前仅限于实验动物，转基因动物／胚胎干细胞。体细胞基因治疗：将治疗的靶基因导入患者体细胞，对生殖系无影响，不会将遗传改变传递给后代。一般以疾病细胞（或正常的免疫细胞）为受体细胞。
1、生殖细胞基因治疗为理想的治疗方法，从根本上可治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。存在问题1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）适用于排卵周期短而次数多的动物。（目前辅助生殖技术的发展有效的解决了单次获取多个卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）
基因治疗的策略1.基因添加疗法(Gene augmentation therapy)2.靶向杀伤特异细胞(Direct killing of disease cells)3.Immune system-assisted cell killing4.靶向抑制基因表达(Targeted inhibition of geneexpression)5.靶向修正缺陷基因(Targeted gene mutationcorrection)
In vivo和Ex vivo基因导入AB
A基因添加疗法→添加功能基因，适用于AR疾病。B直接杀伤细胞→导入自杀基因或原药基因，杀伤疾病细胞。C刺激免疫系统→杀伤疾病细胞。ABC
D .靶向抑制基因表达→反义核酸技术，阻断病变基因表达。E .靶向修正突变基因→同源重组法，原位修复缺陷基因。DE
自杀基因某些基因的表达产物（酶）能将无毒（或低毒）的核苷酸类化合物代谢成特殊中间产物，并进一步生成细胞毒性物而导致细胞死亡。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因，然后给予病人无毒环氧丙苷（GCV）药物。由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物，因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。
反义核酸技术作为基因治疗药物之一，与传统药物相比优点如下：1)特异性强：通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如“生物导弹”；2)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译；3)低毒、安全：无显著毒性，在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解，避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。RNAi可能优于反义核酸技术：siRNA，miRNA
基因治疗的程序1、获取目的基因；2、选择受体细胞；疾病／免疫细胞，易于取出，并能在体外培养和增殖；3、选择载体：质粒载体／病毒载体；4、目的基因的转移：将外源基因转移到靶细胞中。
目的基因转移的方法1、物理方法显微注射法电穿孔法微粒子轰击法2、化学方法磷酸钙沉淀法3、膜融合法脂质体转染法4、受体介导5、病毒介导反转录病毒(retrovirus)腺病毒(adenovirus)腺病毒相关病毒(AAV)
物理方法---显微注射法
病毒介导基因转移（Viral mediated transfer）病毒介导通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。常用的病毒载体:逆转录病毒载体、腺病毒优点:①高效感染宿主细胞，转染率可达100%②病毒基因和所载的外源基因都可能表达③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留
受体介导的基因转移将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒配体细胞膜复合物
人类基因治疗的临床应用1、遗传病的基因治疗：仅适于病情严重且无其他有效治疗措施的单基因遗传病；首次基因治疗成功的遗传病→腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase, ADA)缺乏症；ADA缺乏症→嘌呤代谢障碍→T淋巴细胞受损→严重免疫缺陷。2、肿瘤的基因治疗：靶向杀伤肿瘤细胞、刺激机体免疫系统、靶向抑制癌基因表达、添加野生型抑癌基因和导入耐药基因等。3、抗病毒的基因治疗：艾滋病。
ADA-Gene + vector（逆转录病毒）重组分子患者TLy C IL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内1-2月治疗一次, 10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%
本页为表格页，源文件提取文字存在粘连，表格结构待人工还原。
Ex vivo基因添加治疗ADA缺乏症
“泡泡女孩”
乙型血友病基因治疗我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗：该病为XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，易出血、凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。步骤：逆转录病毒载体+FⅨcDNA=重组体①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③1991年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。
黑色素瘤的基因治疗肿瘤基因治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。ex vivo基因治疗转移的黑色素瘤(TILs：肿瘤浸润淋巴细胞)
利用细胞因子和肿瘤坏死因子基因治疗①IL-2 Gene②TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。
基因治疗存在的问题与伦理学争议A.基因治疗的时效性：如何使外源正常基因持续高效表达1、选择高效的基因转移方法；2、选择适当的载体和受体细胞；3、靶向表达；B.病毒载体的安全：机体免疫反应和肿瘤发生C.多基因病基因治疗尚无良好对策；D.基因治疗与社会伦理道德生殖细胞基因治疗可能改变正常人的遗传基因；后代无权利选择是否治疗END
下载地址：{{downurl}}
{{{a}}}
{{#b}}{{{b}}}
{{/b}} {{/title}} {{#nolog}}登陆注册
{{/nolog}} {{#djsx}}点我刷新
{{/djsx}} {{#gocz}} {{/gocz}} {{#ffqr}} {{/ffqr}}