第1页：第九章 基因分析技术
第九章基因分析技术
第2页：本章重点重组DNA技术（图示）
第3页：本章重点重组DNA技术–限制性内切酶
- 本章重点重组DNA技术–限制性内切酶
- 命名、识别顺序、切口（平/粘末端）–载体（vector）概念、条件、常用载体–克隆(clone)的概念及主要步骤–PCR概念、原理、步骤、应用分子杂交：–探针的概念–探针标记方法:缺口平移法、随机引物法–Southern Blot:原理、步骤、应用–Northern Blot：原理、步骤、应用DNA多态:RFLP，VNTR，STR，微卫星DNA
第4页：20世纪70年代以来
20世纪70年代以来,依赖于分子遗传学的进步，分子生物学技术迅速发展,使人类对人类基因组及单个基因的结构、功能、变异的研究成为现实。本章就一些常用基因工程相关的分子生物学技术予以介绍。
第5页：第一节 重组DNA技术（图示）
1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 19951944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956HbsGlu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位PCR1987G剔除小鼠1989位置克隆第一个基因治疗细菌G组序列1996酵母基因组序列分子遗传学发展重要事件
第6页：第一节 重组DNA技术
第一节重组DNA技术—基因工程重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）人类根据需要选择目的基因（或DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内进行扩增、表达，得到大量相同的DNA片段或表达相应的基因产物，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。该技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。
第7页：一、限制酶和连接酶特异性切断DNA链
- 一、限制酶和连接酶特异性切断DNA链中磷酸二酯键
- 是重组DNA等技术所需的一类重要工具酶。
- 发现于原核生物体内，现已分离出100多种。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)——“分子手术刀”
第8页：1、限制酶的命名
- 1、限制酶的命名
- 根据其来源命名。如：(coli)种名菌株名(RY13)EcoR I(Escherichia )属名编号
- EcoR I来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。
第9页：2、限制酶识别序列和切割形式
- 2、限制酶识别序列和切割形式
- 每种限制酶通常能识别和切割4-8个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）。如：HareIII5′-GGCC-3′Bam HI5′-GGATCC-3′平末端（blunt end）——对称轴切切割形式粘性末端（sticky end）——交错切
第10页：不同限制酶切割产生的限制性片段
不同限制酶切割产生的限制性片段
第11页：互补末端连接
互补末端连接
第12页：产生序列相同的突出末端可有三种方式
- 产生序列相同的突出末端可有三种方式
- 1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致黏性末端的限制酶切割。
第13页：若不同种限制性核酸内切酶识别序列各不相同
- 若不同种限制性核酸内切酶识别序列各不相同,但切割后能产生相同的黏性末端,则称为同尾酶。
- 如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ为一组同尾酶,它们的识别序列和切割位点依次分别是
- 5′-G↓GATCC-3′
- 5′-T↓GATCA-3′
- 5′-A↓GATCT-3′
- 5′-C↓GATCN-3′
- 5′-A↓GATCN-3′
- 它们切割DNA后都形成由GATC组成的黏性末端.由同尾酶酶切产生的DNA片段,能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。
第14页：3、限制酶重要用途
3、限制酶重要用途1)同一种限制酶切割不同来源DNA，产生的黏性末端容易重新连接，进行DNA重组。如：人DNA和质粒DNA等。2)用于人类基因组的DNA分析，如影响到酶切位点的突变、多态等。
第15页：1967年在三个实验室同时发现
- 1967年在三个实验室同时发现
- 一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4-与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶来自噬菌体的T4DNA连接酶
- 经限制酶切割和DNA连接酶的作用，将靶DNA序列和载体DNA连接成重组DNA分子。4、DNA连接酶
第16页：二、基因运载体及其选择载体（Vect
- 二、基因运载体及其选择载体（Vector）
- 将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制增殖（和/或表达）的工具。
第17页：载体具有以下特征
- 载体具有以下特征
- 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；2)有多种限制酶切点/多克隆位点，每种限制酶只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力；4)有可选择的标记基因（如抗药基因等）或报告基因；5)克隆载体上有复制起点，表达载体上有启动子。
第18页：根据载体用途分为
- 根据载体用途分为：
- 克隆载体：外源DNA片段在宿主细胞中复制、拷贝增多。载体上需有复制起始点。
- 表达载体：外源DNA片段或基因在宿主细胞中表达产生蛋白质。载体上还需有启动子。常用的载体：质粒、λ噬菌体、粘粒PI、BAC、YAC用途和分类
第19页：（一）质粒Plasmid
- （一）质粒Plasmid
- 独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子。
第20页：天然质粒不易满足理想运载体的要求
- 天然质粒不易满足理想运载体的要求，多采用人工改建质粒。
- 常用质粒：（原核）大肠杆菌质粒：如pUC19
第21页：质粒载体
- 质粒载体
- 插入外源片段<10kb。具备特点：分子量较小，多克隆位点，抗性基因，复制起始点
第22页：（二）λ-噬菌体
（二）λ-噬菌体(λphage)一种可在体外包装的细菌病毒，可高效感染大肠杆菌。特征:线状双链,全长约50kb。5′末端是12bp突出的互补粘末端，称COS序列。进入宿主细胞后，COS序列碱基配对环化。
第23页：1、置换λ载体
- 1、置换λ载体
- 外源DNA片段取代λ噬菌体DNA分子中间部分的基因。可携带片段：9-23kb2、插入λ载体：外源DNA片段，插入λ基因组的CI基因。可携带片段：<10kb
第24页：（三）粘粒(cosmid vector)
（三）粘粒(cosmid vector) 将质粒和λ噬菌体改造的载体，改造后含λ噬菌体的COS序列以及质粒（plasmid）特性 可携带片段：30-45kb 多用于基因文库构建
第25页：(四)大片段DNA克隆载体
(四)大片段DNA克隆载体人类和哺乳动物许多单个基因相当大（如：DMD gene2300kb），克隆、表达分析需更大的基因载体。近年来人工构建的一些载体：PⅠ，BAC，YAC等。
第26页：1、噬菌体PⅠ载体和PAC
- 1、噬菌体PⅠ载体和PAC
- PⅠ噬菌体：其DNA为线性，110～115kb，体外包装于蛋白质壳内。PⅠDNA进入宿主细胞后环化、扩增。携带外源DNA片段:70-100kb
- PAC：PⅠ和F因子结合产生PⅠ人工染色体克隆系统。携带外源DNA片段:130-150kb
第27页：2、细菌人工染色体
- 2、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）
- 基于大肠杆菌的F因子构建的、高通量低拷贝的质粒载体。（F因子是大肠杆菌中自然存在的一种致育质粒，编码多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质）
- BAC携带：抗生素抗性标记、复制子oriS、易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB，parC等）
- 它不同于一般质粒，能携带外源DNA片段>300kb。
第28页：YAC的结构特征1）着丝粒
- YAC的结构特征1）着丝粒
- 有丝分裂姊妹染色单体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：染色体自主复制的起点。与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。携带外源DNA片段：0.2-2Mb3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）
第29页：端粒、着丝粒与自主复制元件
2个端粒1个着丝粒1个自主复制元件（ARS）
第30页：三、DNA重组与分子克隆克隆（clo
- 三、DNA重组与分子克隆克隆（clone）
- 是指用无性繁殖的方法获得同一个体细胞或分子的大量复制品。DNA克隆，亦称分子克隆:将分离得到的目的基因与载体DNA重组，用适当方法导入宿主细胞并使之在宿主细胞中扩增得到大量相同DNA片段的技术。
第31页：基本原理与主要步骤1.分离纯化目的基因
基本原理与主要步骤1.分离纯化目的基因;2.构建重组DNA分子;3.宿主细胞的转化;4.细胞克隆的选择性筛选,筛选含有重组DNA细胞;5.分离重组DNA克隆。基本原理:将DNA片段在体外重组并在适当的宿主细胞中增殖。DNA克隆主要步骤：
第32页：1、分离纯化目的基因
- 1、分离纯化目的基因
- 从基因组中分离目的基因；
- 由特定mRNA逆转录合成cDNA；
- 化学合成目的基因；
- PCR体外扩增目的片段。
第33页：2、构建重组DNA分子
- 2、构建重组DNA分子
- 目的基因+载体
第34页：重组的DNA分子导入特异宿主细胞的过程
重组的DNA分子导入特异宿主细胞的过程称转化。重组DNA分子导入细菌后，随细菌繁殖不断复制和扩增，最终得到大量相同拷贝的目的DNA。3、宿主细胞的转化
第35页：4、筛选含有重组DNA的细胞
4、筛选含有重组DNA的细胞将转化的细胞置于琼脂表面，刺激细胞克隆生长，由单个细胞增殖形成遗传相同的细胞群体——故称细胞克隆。将阳性的克隆移至液体培养基中进行扩增。5、分离重组DNA克隆：收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。
第36页：细胞克隆选择增殖
细胞克隆选择增殖
第37页：四、目的基因表达
- 四、目的基因表达
- 将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞表达出相应基因产物（蛋白）。
- 获得基因重组后产物——蛋白质。如胰岛素、干扰素；生产疫苗的抗原等。此类克隆系统称表达克隆（expression cloning）。
第38页：目的基因表达
目的基因表达
第39页：（一）真核细胞基因在原核细胞
（一）真核细胞基因在原核细胞（细菌）中表达真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列），提供特定多肽信息；2）适当的表达载体。产物特征：1）原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），不能有效地进行翻译后修饰而不稳定；2）活性受限或无活性。
第40页：（二）真核细胞基因在真核细胞中表达
- （二）真核细胞基因在真核细胞中表达
- 真核细胞如酵母或昆虫细胞作为宿主细胞,提供一个相似但又不相同的基因表达环境。
- 产物特点：具有翻译后加工如糖基化等有利于蛋白的稳定和功能活性。
- 应用：大量制备真核细胞蛋白质，研究特定基因表达。
第41页：五、基因文库(DNA文库)DNA文库
- 五、基因文库(DNA文库)DNA文库（DNA library）
- 指通过DNA克隆(重组)技术人工构建的包含某一特定来源DNA所有片段的重组DNA克隆总和。DNA来源不同：可构建不同的DNA文库。1.基因组DNA文库2.染色体特异的基因文库3.cDNA文库（cDNA library）
第42页：基因组DNA文库
- 基因组DNA文库
- 应用DNA重组技术构建的含有基因组全部DNA序列的DNA克隆总和。
- DNA来源
- 人类几乎所有细胞的核基因组DNA相同，可用易得到的外周血细胞DNA制备基因组DNA文库。
- 用途
- 该文库包含人类所有DNA序列。用核酸杂交技术从中筛查和分离目的基因。
第43页：构建基因组DNA文库
构建基因组DNA文库
第44页：筛查含有目的基因的细胞克隆
筛查含有目的基因的细胞克隆
第45页：染色体特异的基因文库
染色体特异的基因文库（chromosome specific library）单个染色体→细胞克隆（流式细胞仪）↓细胞→染色体染色体DNA文库染色体区带→区带特异(显微切割）↓DNA文库
第46页：cDNA文库
cDNA文库（cDNA library）材料来源：特定组织细胞一定发育阶段总RNA。
第47页：第二节 分子杂交及相关技术分子杂交
第二节分子杂交及相关技术分子杂交（molecular hybridization）核酸分子杂交蛋白分子杂交Western Blot：检测蛋白质Southern Blot：检测DNANorthern Blot：检测RNA
第48页：核酸分子杂交
核酸分子杂交（Nucleic acid molecular hybridization）标记的核酸探针变性后与变性的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。其目的是鉴定分析复杂的靶DNA/RNA中与探针同源的核酸片段。双链DNA变性（解链）主要取决于：1．链的长度：链越长，解链需要的能量越多。2．碱基成分：GC含量高，较难变性。3．化学环境：单价阳离子稳定双链；甲酰胺、尿素破坏双链。
第49页：一、基因探针（gene probe）
- 一、基因探针（gene probe）基因探针（gene probe）
- 是指一段与目的基因或DNA/RNA片段特异互补的核苷酸序列。–可以是整个基因，或是基因的一部分；–可以是DNA，也可以是RNA。
第50页：（一）探针的种类与制备1、基因组探针
- （一）探针的种类与制备1、基因组探针
- 从已建立的基因组文库中筛选和分离所需目的基因。克隆扩增大量的DNA探针也可用PCR方法合成。
第51页：2、cDNA探针
- 2、cDNA探针
- 从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因，也可用RT-PCR方法合成。3、寡核苷酸探针:根据已知基因序列合成一段互补的DNA片段。一般长约15-50个bp。
第52页：（二）探针的标记将探针标记上一种标识物
（二）探针的标记将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。标记方法：1、缺口平移法2、随机引物法3、DNA末端标记法：利用多聚核苷酸激酶用32P置换5′端磷酸或将32P添到酶切后的5′黏性末端。
第53页：缺口平移法
- 缺口平移法（Nick Translation）原理及过程：
- 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口；
- DNA聚合酶I具有5′→ 3′外切酶活性，在缺口处按5′→ 3′方向切除单核苷酸；
- DNA聚合酶I还具有5′→ 3′聚合酶活性，在缺口处3′端加入底物中单核苷酸，弥补缺口处核苷酸链。
- 随反应进行，底物中被标记单核苷酸随机掺入。DNA聚合酶I两种作用交替进行，探针即被标记。
第54页：随机引物法（六核苷酸引物标记法）（图示）
Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP
第55页：随机引物法（六核苷酸引物标记法）
- 随机引物法（六核苷酸引物标记法）原理及过程：
- 利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5′→ 3′聚合酶活性。
- 待标记DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow酶催化下，按5′→ 3′方向合成DNA新链。
- 反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成DNA链中，探针被标记。
第56页：（一）Southern （图示）
随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-dNTP6bp primerKlenow,dNTP变性——复性
第57页：（一）Southern Blot
- （一）Southern Blot（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（三）Northern Blot
- 二、核酸杂交常用的方法
第58页：（一）Southern blot1975
（一）Southern blot1975年，英国科学家Southern首创，是检测DNA的经典方法。1、原理：碱基互补(DNA-DNA)2、步骤：:提取组织或细胞DNA限制酶消化DNA片段电泳分离变性转移至尼龙膜标记探针、变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析
第59页：-+Southern blot探针
-+Southern blot探针
第60页：3、应用遗传学研究及临床基因诊断
3、应用遗传学研究及临床基因诊断等(1)基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测(2) DNA多态检测：RFLP连锁分析等
第61页：（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交
- （二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleotide, ASO）
- 适用于基因突变部位和性质已完全明确。
- 合成ASO探针，大小20bp左右，标记后用于杂交检测。
- 检测点突变时一般需设计合成两种探针：正常探针5′-AGT-3′只与正常基因序列杂交形成稳定杂交体突变探针5′-AAT-3′只与突变基因序列杂交形成稳定杂交体
- PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后产物——突变基因检测。
第62页：例:PKU产前诊断Ⅱ2进行产前基因诊断结
- 例
- PKU产前诊断Ⅱ2进行产前基因诊断结果分析Ⅱ2为正常个体正常探针突变探针12ⅠⅡ12
第63页：（三）Northern blot检测RN
（三）Northern blot检测RNA分子，应用特异性基因探针分析基因转录水平。1、原理：碱基互补配对2、步骤：提取组织或细胞总RNA↓提纯分离mRNA↓琼脂糖凝胶电泳分离RNA↓转移至尼龙膜↓杂交检测
第64页：Northern Blot
Northern Blot
第65页：分子杂交及相关技术
- 3、应用
- （1）检测mRNA分子量大小（依电泳迁移率估计）
- （2）检测mRNA的含量，即基因表达水平高低（密度扫描仪，定量分析）
第66页：三、Western blot蛋白水平
三、Western blot蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理：抗原抗体特异性结合。抗原抗体反应步骤：组织或细胞↓提取蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白↓转移（印迹）于膜上↓加抗体检测某种特异性蛋白质
第67页：Western Blot
Western Blot
第68页：四、生物芯片技术生物芯片
四、生物芯片技术生物芯片，包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。是一种微型多参数生物传感器。在一微小固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其他生物组分准确，快速、大量地筛选或检测。基因芯片（又称DNA芯片，DNA微列阵），它集成了大量密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能同时分析大量基因，实现生物基因信息的大规模检测。
第69页：基因芯片的应用基因组（图示）
第70页：基因芯片的应用基因组扫描基因型及单碱基多
基因芯片的应用基因组扫描基因型及单碱基多态性（SNP）突变检测基因功能研究基因表达分析等
第71页：五、聚合酶链反应（图示）
第72页：五、聚合酶链反应（polymeras
五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）概念：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，体外程序化地特异性扩增某一DNA片段的技术。Kary B. Mullis
第73页：分子杂交及相关技术PCR
PCR
第74页：分子杂交及相关技术原理（图示）
74
第75页：分子杂交及相关技术原理
- 原理
- 模拟体内DNA复制条件步骤：1）合成与待扩增区域两端已知DNA序列互补的特异性寡核苷酸引物。引物序列决定扩增片段特异性及长度。2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer，引物，去离子水3）反应程序：变性94~95oC复性延伸50~65oC 70~72oC72oC延伸10min30个循环，DNA扩增100万倍
第76页：PCR扩增
PCR扩增
第77页：PCR特点及应用特点
- PCR特点及应用特点：
- （1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快速。
- （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：生命科学疾病诊断法医学考古学等缺点：
- （1）产物片段较短。
- （2）DNA复制不精确。
第78页：在同一PCR体系中加入数对PCR引物
- 在同一PCR体系中加入数对PCR引物，引物要求：引物退火温度相近所覆盖区域不重叠扩增片段长度不同可同时扩增多个DNA片段，并可经电泳分离检测。应用：检测同一基因多个外显子缺失检测缺失时设置内对照。1、多重PCR
- 六、PCR相关技术
第79页：2、RT-PCR以mRN（图示）
第80页：2、RT-PCR以mRNA
2、RT-PCR以mRNA为模板，经逆转录合成cDNA，再以特异性引物进行PCR扩增。优点：微量mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng~ug水平），大大提高mRNA检出灵敏度。应用:检测基因表达水平，属于半定量检测。
第81页：RT-PCR
RT-PCR
第82页：七、单链构象多态性（Single S
七、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）原理:单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，该差异使相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。应用：DNA中单个碱基替代、微小缺失或插入检测。
第83页：分子杂交及相关技术过程
- 过程
- 1、在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物；2、进行PCR扩增3、产物经甲酰胺等变性，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶）。4、突变分析：突变引起DNA构象差异表现为电泳带位置的差异。
第84页：PCR-SSCP过程
PCR-SSCP过程---------------------------primer---------------------------↓ 32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳↓ 1 2 3 4 5自显影↓结果分析解链构像DNA原理过程
第85页：人类基质修复基因NEIL1突变
人类基质修复基因NEIL1突变
第86页：第三节 DNA多态DNA多态
- 第三节DNA多态DNA多态（DNA Polymorphism）在一个群体中存在由遗传决定的两种或两种以上的基因型，其中频率最低的形式也远远高于依赖突变所能维持的频率。对于同一基因座上的两个或两个以上的等位基因，等位基因频率至少为0.01,携带该等位基因的杂合子的频率大于2%，认为该基因座具有多态性，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。
- 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。
- 突变与多态：
第87页：DNA分析中常用的多态性标记1）
DNA分析中常用的多态性标记1）第一代多态性标记:限制性片段长度多态性（RFLP）；2）第二代多态性标记:重复序列多态性（VNTR）、短串联重复序列（STR）；3）第三代多态性标记：单碱基多态性（SNP），为DNA序列的单个核苷酸的差别。
第88页：一、限制性片段长度多态性（Restr
- 一、限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP）
- 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称RFLP。
- RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。
第89页：Allele II酶切位点消失RFLP
Allele II酶切位点消失RFLP—Southern blot检测结果
第90页：二、数目变异串联重复（variabl
- 二、数目变异串联重复（variablenumbertandemrepeats, VNTR）
- 重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR。
- 散在分布于染色体上。
- 重复单位6～25bp长，称为小卫星DNA。重复单位2～6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。
第91页：VNTR两侧酶切位点固定
- VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。
- DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment lengthpolymorphism,Amp-FLP）大小
第92页：PCR-VNTR检测
PCR-VNTR检测
第93页：PCR-VNTR
PCR-VNTR
第94页：三、SNP基因组水平上由单个核苷酸的
三、SNP基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态
第95页：MTHFR多态
MTHFR多态(C667T) PCR-RFLP分析结果，多态可被HinfI酶切识别。C等位基因酶切后片段为400bp，T等位基因酶切后片段为318bp和82bpA:MTHFRRFLP结果B、C:MTHFR677CC和677TT测序
第96页：本章重点重组DNA技术–限制性内切酶
- 本章重点重组DNA技术–限制性内切酶
- 命名、识别顺序、切口（平/粘末端）–载体（vector）概念、条件、常用载体–克隆(clone)的概念及主要步骤–PCR概念、原理、步骤、应用分子杂交：–探针的概念–探针标记方法:缺口平移法、随机引物法–Southern Blot:原理、步骤、应用–Northern Blot：原理、步骤、应用DNA多态:RFLP，VNTR，STR，微卫星DNA
