页数：47页文件大小：485.0 KB来源： 医学遗传学ppt课件
本课件讲解基因操作核心技术，介绍限制性内切酶、常用运载体与插入片段容量、目的基因的获得途径，展开核酸分子杂交、探针标记、Southern与Northern印迹，并说明PCR的原理、体系设计与常见应用。
重组 DNA 技术（recombination DNAtechnique）指将目的 DNA 片段或人工合成的基因，通过载体在体外重组、转移并插入到另一种生物的基因组中，使其表达为新的性状或用于进一步的研究，是基因操作的核心技术。包括 DNA 克隆（DNAcloning）和分子杂交（molecularhybridization）。重组 DNA
重组 DNA 技术流程简图 ligasevectorrestrictionendonucleaseforeign DNAbacterial cellhost
Eco RⅠ属名种名菌株名酶的序号限制性内切核酸酶限制酶：能够识别 DNA 链的特定部位并能进行切割。
进行 DNA 重组，需要载体 DNA 和外源 DNA 具有相同序列的粘性末端。
识别不同序列，但能产生一致粘性末端的限制酶限制性内切核酸酶
DNA 连接酶一种封闭 DNA 链上缺口的酶，借助 ATP 水解提供的能量催化 DNA 链的 5’-PO4 与另一 DNA 链的 3’-OH 生成磷酸二酯键。
运载体（Vector）运载体是能将外源目的 DNA 导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。
分子量小。
有多种限制酶切位点。
克隆载体&表达载体运载体（Vector）运载体是能将外源目的 DNA 导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。
质粒是存在于许多细菌中，独立于染色体外的双链闭合环状 DNA 分子。质粒（plasmid）
本页以图示为主，源文件提取到的标注文字存在粘连：agtgaatt CGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcatp UC192686 bp Ori Ap RLac ZEco RⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠXbaⅠBam HⅠSalⅠSphⅠPstⅠHindⅢ质粒（plasmid）。建议对照原图核对。
λ噬菌体是一种可在体外包装的细胞病毒，能高效感染细菌细胞并在其中克隆中等长度的 DNA 片段的载体。λ噬菌体（Lambda phage）
粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种人工载体。Cosmid 只含有λ噬菌体的复制起点，抗性标记(来自质粒)以及 cos 粘性末端，多用于构建高等生物的基因文库。粘粒（cosmid）
可与同源序列质粒重组粘粒（cosmid）粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种人工载体。
p JB85.4 kb Bam HⅠClaⅠHindⅢcos Ori Amp RSalⅠ粘粒（cosmid）
| 载体 | 插入片段大小 |
|---|---|
| 质粒（Plasmid） | 0～10 kb |
| λ噬菌体内插型载体（Insertion λ vector） | 0～10 kb |
| λ噬菌体置换型载体（Replacement λ vector） | 9～23 kb |
| 黏粒（Cosmid） | 33～44 kb |
| P1 噬菌体（P1 phage） | 70～100 kb |
| PAC | 130～150 kb |
| BAC | 300 kb |
| YAC | 0.2～2.0 Mb |
说明：本页源文件文字与数字存在粘连，表格已按课件通用表述还原，建议对照原课件图片核对后使用。
本页以图示为主，源文件提取到的标注文字存在粘连：agtgaatt CGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcatp UC192686 bp Ori Ap RLac ZEco RⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠXbaⅠBam HⅠSalⅠSphⅠPstⅠHindⅢ重组 DNA 克隆的分离。建议对照原图核对。
Amp Amp＋X-gal 重组 DNA 克隆的分离蓝白筛选
寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)
简并探针(degenerateprobe)探针的制备与应用
简并探针（degenerateprobe）Leu Cys Ile Tyr Met His Gln Asp Ser CTTCAGTGTCATTCATATCCATCATGCAAGGATCTCTCAGTTAGAGTC 探针的制备与应用
单一 EST 探针(unique EST-baseprobe)探针的制备与应用探针(probe)：分子杂交检测其互补序列的标记 DNA 或 RNA 序列，能在许多 DNA 或 RNA 序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子。
寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)
缺口平移法(nicktranslation)探针的标记及方法
随机引物延伸法(random-primed labeling)
PCR 标记法(PCR amplification)
本页以图示为主，源文件提取到的标注文字存在粘连：allele-specificoligonucleotide,ASO；dotandslothybridization。建议对照原图核对。
ASO 杂交 His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala CAT CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCCHis Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala CAT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCCCTG ACT CCT GAG GAG AAG TCTCTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCTCTG ACT CCT GTG GAG AAG TCTASO 杂交
Southern 印迹（Southernblot）分子杂交
Northern 印迹（Northernblot）
Southern 印迹（Southernblot）分子杂交
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），是一种在体外(invitro)短时间内大量、迅速的选择扩增特定的靶 DNA 序列的核酸扩增方法。
Mullis FThe Nobel Prize in Chemistry 1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"聚合酶链式反应（PCR）
Denatures the double stranded DNAinto single strands95℃72℃55℃聚合酶链式反应（PCR）
Allows the primers to attach tocomplementary strand of DNA 聚合酶链式反应（PCR）
Optimaltemperaturefor Taqpolymerasetoattachtoandextendthenewstrandof DNA 聚合酶链式反应（PCR）
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