10 基因定位与基因克隆.ppt

第1页：基因定位与克隆封面

• 医学遗传学基因定位与克隆

第2页：本章节重点

• 本章节重点
• 基因定位和基因克隆的概念
• 连锁分析
• 遗传标记
• 基因克隆的策略

第3页：基因定位

基因定位(genemapping)

利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。

1911 年，Wilson 将红绿色盲基因定位到 X 染色体

1968 年，Duffy 血型基因定位于 1 号染色体

第4页：基因克隆

基因克隆(genecloning)

用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。基因定位(genemapping)：利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置上。

第5页：连锁分析

连锁分析(linkageanalysis)

利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁分析

第6页：连锁分析（续一）

• 连锁分析

第7页：连锁分析（续二）

• 连锁分析

第8页：连锁分析（续三）

• 连锁分析

第9页：连锁分析（续四）

• 连锁分析

第10页：连锁分析（续五）

• 连锁分析

第11页：重组值

重组值(recombinationfraction)

是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。

• 厘摩(centimorgan，c M)连锁分析

第12页：遗传标记

遗传标记用连锁分析法进行基因定位时需要的一些已知遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且具有多态性以便显示连锁关系，这些标记位点称为遗传标记（geneticmarker）。

第13页：遗传标记的类型

• 血型，血清蛋白，HLA
• DNA RFLP
• DNA STR&DNA VNTR
• SNP 遗传标记

第14页：重组值与减数分裂数

重组值＝0.3

85 个减数分裂遗传标记

• 重组值＝0：10 个减数分裂

第15页：连锁分析（续六）

• 连锁分析

第16页：NF1基因的RFLP连锁分析

Eco RⅠEco RⅠEco RⅠ3.0 kb1.7 kb 探针 Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ121234567812345678 连锁分析

第17页：RFLP片段长度分析

Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ1212345678123456783.0 kb1.7 kb4.7 kb 连锁分析

第18页：3.0kb与4.7kb片段

4.7kb3.0kb Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ121234567812345678 连锁分析

第19页：RFLP家系分析

Neurofibroma,NF1RFLPⅠⅡⅢ1212345678123456784.7kb3.0kb 连锁分析

第20页：Lod优势对数法

• 1955，Morton:优势对数法(Lod)
• +3 表示连锁存在
• -2 表示连锁不存在连锁分析

第21页：多点连锁定位

多点连锁定位利用三点杂交法(threepointcrosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确的进行基因定位。连锁分析

第22页：三点杂交与多点连锁定位

数目重组位置子代类型 853 非重组体 ABC/abcabc/abc5(A，B)–×-CABc/abcab C/abc47A–×–(B，C)a BC/abc Abc/abc95B–×–(A，C)Ab C/abca Bc/abc 多点连锁定位

疑似多点连锁定位分析结果表，原文粘连，待人工还原。

第23页：体细胞杂交

体细胞杂交(somaticcellhybridization)又称细胞融合(cellfusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybridcell)。

• 病毒诱导的细胞融合——仙台病毒
• 化学融合技术——聚乙二醇(PEG)
• 电融合技术——电穿孔法体细胞杂交

第24页：体细胞杂交（续）

• 体细胞杂交

第25页：异核细胞

• 异核细胞体细胞杂交

第26页：合核细胞与杂种细胞

• 体细胞杂交合核细胞杂种细胞

第27页：杂种细胞的染色体丢失

两个同种的动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双亲的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双亲的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。体细胞杂交

第28页：HAT选择系统

• HAT 选择系统
• 1962，人类 HPRT-
• 1964，小鼠 TK-
• H：次黄嘌呤(hypoxanthine)
• A：氨基喋呤(Aminopterin)
• T：胸腺嘧啶(Thymidine)

第29页：HAT选择系统原理

• HPRT－TK－HAT 选择系统

第30页：HAT选择系统（续）

• TK－HPRT－HAT 选择系统

第31页：HAT选择系统（续二）

• HAT 选择系统

第32页：体细胞杂交与17号染色体

体细胞杂交 TK

chromosome 17

第33页：杂种细胞克隆嵌板

本页以图示为主，源文件提取到的标注文字存在粘连：杂种细胞克隆嵌板 Human chromosome Hybridclone87654321----++++A--++--++B-+-+-+-+C。建议对照原图核对。

第34页：微细胞融合

微细胞融合(microcell fusion)体细胞杂交人工建立的仅含有一条人类染色体的杂种细胞，即微细胞，再与啮齿类细胞进行融合。

第35页：区域定位

区域定位(regional assignment)体细胞杂交依据染色体结构畸变的特点，建立只含有特殊的部分人类染色体的杂种细胞，再与啮齿类细胞进行融合。

第36页：辐射杂种

辐射杂种(radiation hybrid)体细胞杂交用含有辐射切割的人类染色体片段的细胞与啮齿类细胞融合产生的杂种克隆细胞。

1994 年，Walter 建立全基因组放射杂种

• 1975 年，Goss 和 Harris 提出
• 1990 年，Cox 构建单染色体杂种细胞

第37页：原位杂交

原位杂交(In Site Hybridization，ISH)：利用同位素标记的 DNA 探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种直接进行基因定位的方法。原位杂交技术

第38页：原位杂交（续）

• 原位杂交技术

第39页：荧光原位杂交FISH

荧光原位杂交(FISH)

用特殊的荧光素标记 DNA 探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。原位杂交技术

第40页：荧光原位杂交（续）

• 原位杂交技术

第41页：网络定位资源

http

//www.ncbi.nlm.nih.gov

http

//genome.ucsc.edu

• 网络定位

第42页：基因克隆

基因克隆(genecloning)

用一定的方法把不同位点上的基因分离出来。基因克隆

第43页：功能克隆

功能克隆(functionalcloning)是先研究相关基因的功能，再定位克隆该基因。

血红蛋白病 Hb S——血红蛋白缺陷(1949)——β链 Glu6Val GAG→GTG——11p(70 年代)功能克隆

第44页：定位克隆

定位克隆定位克隆(positionalcloning)是将遗传病或发育异常畸形与相关表型之间，和由这些突变失活的基因所编码的特定蛋白质之间联系起来，而提供的一种基因定位克隆方法。

第45页：定位克隆的等级

应用细胞遗传学或连锁分析方法将基因定位于染色体的特定区域

• 定位克隆
• 定位克隆的等级
• 从该区域内所有可能的候选基因中确定正确的基因

第46页：定位克隆的基本方法和步骤

收集家系，选择遗传标记进行连锁分析，对目的基因作图定位

• 定位克隆
• 定位克隆的基本方法和步骤
• 确定候选位置，对目的基因进行精细定位
• 从候选基因中确定正确的基因

第47页：用定位克隆法鉴定的致病基因

本页以图示为主，源文件提取到的标注文字存在粘连：疾病年代疾病年代 Menkes 病 X 连锁无丙种球蛋白血症肾上腺白质营养不良 1993 慢性肉芽肿瘤 Duchenne 肌营养不良视网膜母细胞瘤 1986 神经纤维瘤Ⅱ型囊性纤维变性 1989Huntington 病 Von Hippel-Lindou 病脊髓小脑性共济失调Ⅰ型 Wilson 病 Wilms 瘤神经纤维瘤Ⅰ型睾丸决定因子(TDF)。建议对照原图核对。

第48页：定位克隆鉴定的疾病与年代

用定位克隆法鉴定的致病基因疾病年代疾病年代 Friedreich 共济失调进行性肌阵挛癫痫长 QT 综合征(11 号染色体)Werner 综合征 X 连锁视网膜色素变性(RP3)多囊肾病 2 型基底细胞痣综合征无汗型外胚层发育异常血色病 Chediak-Higashi 综合征青年的成年期发病型糖尿病(MODY)(12 号染色体)1996 点状软骨发育不全

第49页：候选基因的序列分析

ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMet Val Ser Leu Gln Pro Met Val Ser Leu Stop 定位克隆

第50页：候选克隆

候选克隆候选克隆(candidatecloning)是一种用定位和非定位的信息相结合来克隆致病基因，即根据一些基因的位置、表达、功能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。

第51页：定位候选克隆

定位候选克隆 GDB 或 Gen Bank 已知的基因或 EST 与疾病关系确定致病基因候选克隆

第52页：功能候选克隆

功能候选克隆 GDB 或 Gen Bank 已知基因已定位的疾病与该基因关系确定致病基因

• 候选克隆

第53页：本章节重点回顾

• 本章节重点
• 基因定位和基因克隆的概念
• 连锁分析
• 遗传标记
• 基因克隆的策略