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07 Spectroscopy.ppt

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本课件讲授光谱分析：从波数、波长与光子能量的关系出发，介绍棱镜色散、分光光度计与荧光计的原理，重点推导比尔-朗伯定律与消光系数的单位，给出分析方法建立步骤与标准曲线要求，并列出各波段比色皿材质、光源与生色团吸收波长。

本页为图片内容，位于「波数、波长与频率」与「棱镜色散」之间（连续图片页第 1 页）。

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第1页：辐射能的光谱分布

本页主题为辐射能的光谱分布（Spectral Distribution of Radiant Energy），以波数（cycles/cm）为横坐标表示不同波段的辐射能分布。

第2页：波数、波长与频率

ν（波数）: 单位 cm⁻¹。
λ: 波长。
C: 辐射速度（常数）= 3 × 10¹⁰ cm/sec。
υ: 辐射频率（cycles/sec）。
光子能量: h（普朗克常数）= 6.62 × 10⁻²⁷（Erg·sec），C = υλ。

第3页：

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第6页：棱镜对复合光的色散

棱镜可把光谱展开，再由狭缝选取所需要的某一波长（λ）。

第7页：分光光度计

分光光度计：能够在任意波长下测定样品光密度（吸光度）的仪器。

第8页：荧光计

荧光计：测定样品在特定条件下受紫外光照射后所发射荧光强度的仪器。

第9页：比尔-朗伯定律

随着液层（比色皿）厚度增加，透射光强度 I 减小。

第10页：透射率与吸光度

I₀ 为入射光强度，I 为透射光强度；% 透射率 = 100 × I/I₀。

吸光度（A，即光密度 OD）= log（I₀/I）= 2 − log %T，且与溶液浓度 C 成正比，与光程长度 L 成正比。

第11页：A = KCL 与消光系数

A ∝ CL = KCL，即为比尔-朗伯定律。

K（比消光系数）: 每升溶液含 1 g 溶质时的消光系数。
E（摩尔消光系数）: 每升溶液含 1 克分子溶质时的消光系数，A = ECL。

第12页：E 与 K 的关系及单位

摩尔消光系数 E 与比消光系数 K 相差一个分子量的因子。

单位：A = ECL，A 为无单位的数值。

第13页：比尔-朗伯定律中的单位

摩尔浓度体系: L 以 cm 计，C 以 mol/L 计，A = ECL，A 无单位。
质量浓度体系: L 以 cm 计，C 以 g/L 计，A = KCL，K 的单位为 L/（cm·g）。

第14页：建立分光光度分析方法的步骤

对样品进行光谱扫描。
确定最大吸收波长，获得单色光波长。
用比尔-朗伯方程 A = KCL 计算样品浓度。

第15页：分光光度计读数

本页主题为分光光度计读数（SPECTROPHOTOMETR READINGS），源文件仅给出标题，具体读数示例建议对照原课件图片补充。

第16页：紫外光谱

本页为紫外光谱图（ULTRAVIOLET SPECTRUM），源文件仅给出标题，吸收峰位置与纵坐标建议对照原课件图片补充。

第17页：线性范围与外推的限制

吸光度 A 与浓度 C 只在一段范围内呈线性关系；绝不可外推到已知线性范围之外的点。

第18页：标准曲线法进行光谱分析

绘制标准曲线时应避免过高或过低的吸光度，吸光度在 0.1 < A < 1 时结果最好；以吸光度对浓度作图得到直线。

第19页：不同波段比色皿材质

各波段分光光度计的比色皿材质
仪器类型	比色皿材质
紫外分光光度计	石英（结晶二氧化硅）
可见分光光度计	玻璃
红外分光光度计	NaCl

第20页：不同波段的光源

各波段分光光度计的常用光源
仪器类型	光源
紫外分光光度计	氢灯；汞灯
可见分光光度计	钨灯
红外分光光度计	金刚砂（SiC）

第21页：化学结构与紫外吸收：生色团

生色团：分子中含有能在紫外区产生吸收的电子体系的基团。

第22页：生色团结构与吸收波长

常见生色团的结构与其紫外吸收波长
基团	结构	吸收波长（nm）
羰基 Carbonyl	>C=O	280
偶氮 Azo	—N=N—	262
硝基 Nitro	—N=O	270
硫酮 Thioketone	—C=S	330
亚硝酸酯 Nitrite	—NO₂	230
共轭二烯 Conjugated Diene	—C=C—C=C—	233
共轭三烯 Conjugated Triene	—C=C—C=C—C=C—	268
共轭四烯 Conjugated Tetraene	—C=C—C=C—C=C—C=C—	315
苯 Benzene	苯环	261

第23页：紫外光谱的应用

蛋白质测定。
氨基酸（芳香族氨基酸）测定。
泛酸测定。
葡萄糖测定。
酶活力测定（己糖激酶）。

第24页：荧光计的应用

硫胺素（激发 365 nm，发射 435 nm）。
核黄素。
维生素 A。
维生素 C。

第25页：可见分光光度计的应用

烟酸。
吡哆醇（维生素 B₆）。
维生素 B₁₂。
金属测定（铁）。
脂肪品质测定（TBA 法）。
酶活力测定（葡萄糖氧化酶）。

第26页：计算例题（一）

从大肠杆菌中纯化的 DNA 溶液，在 pH 4.5、1 cm 比色皿中于 260 nm 处吸光度为 0.793，若 E₁%¹ᶜᵐ 为 197，求溶液浓度（mg/ml）。
根据 1 cm 比色皿中测得的数据（溶液 A、B 的浓度 C×10⁵ M、入射光强 I₀ 与透射光强 I），求 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.0）中水合钴胺素在 351 nm 处的摩尔消光系数 E。

说明：源文件该页例题 2 的浓度与光强数字连排，无法安全判定各列对应关系，故未还原为数据表，具体数值建议对照原课件图片核对。

第27页：计算例题（二）

化合物 x 的摩尔消光系数 E = 3 × 10³ L/（cm·mol），1 cm 比色皿中 350 nm 处吸光度为 0.9，求样品中化合物 x 的浓度。
化合物 Y 浓度为 2 × 10⁻⁴ mol/L，用 1 cm 石英比色皿在 300 nm 处吸光度为 0.4，求其摩尔消光系数。
根据 1 cm 比色皿中溶液浓度（C×10⁵ M）、入射光强 I₀ 与吸光度 A 的数据，求 pH 7.0、0.1 M 磷酸缓冲液中水合钴胺素在 351 nm 处的摩尔消光系数 E。

第28页：例题：吸光度换算为 ppm

已知 A = 0.01，E = 10000 L/（mol·cm），L = 1 cm，由 A = ECL 得：

C = 0.01 ÷（10000 L/mol·cm × 1 cm）= 1 × 10⁻⁶ mol/L。

按分子量 236 g/mol 折算：1 × 10⁻⁶ mol × 236 g/mol ÷ 1000 cm³ = 2.36 × 10⁻⁷ g/cm³。

因 1 ppm = 1 μg/cm³ = 10⁻⁶ g/cm³，故结果为 0.236 ppm。